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       【摘要】 
       目的研究蜈蚣多糖对人宫颈癌细胞Hela细胞的抑制作用及作用机制。方法用MTT法检测蜈蚣多糖对Hela细胞生长的抑制作用；流式细胞仪和Annexin V-FITC/PI双荧光染色分别检测蜈蚣多糖对Hela细胞周期及凋亡情况的影响。结果在一定浓度范围内蜈蚣多糖可显著抑制Hela细胞的增殖，改变Hela细胞的细胞周期，使细胞阻滞于G2/M期，并能诱导细胞凋亡。结论蜈蚣多糖可能通过改变Hela细胞的细胞周期，诱导细胞凋亡，从而对Hela细胞的增殖有一定的抑制作用。
       【关键词】  蜈蚣多糖；细胞周期；细胞凋亡
       Effects of Polysaccharide from Scolopendra subspinipes mutilans on Proliferation of Hela Cells
       LI Xingnuan, HAN Yali, YU Weiguo
       1. Medical College of Jiujiang University, Jiujiang 332000, China; 2. Bioengineering Department, Guangdong University of Technology, Guangdong, Guangzhou 510090, China; 3.No. 91960 Hospital of PLA, Shantou, 515074, China
       Abstract:ObjectiveTo investigate the inhibitory  effects of polysaccharide from Scolopendra subspinipes mutilans (PSSM) on Hela cells and its mechanism. MethodsMTT assay was used to test the effect of growth inhibition on Hela cells. Cell cycle and cell apopotsis were detected by flow cytometry and AnnexinV-FITC/PI fluorescence staining.ResultsPSSM could obviously inhibit the proliferation of Hela cells at specific concentration range, change the cell cycle of Hela cells and block Hela cells at G2/M phase, and induce cell apoptosis.ConclusionPSSM can inhibit the growth of Hela cells by changing cell cycle and inducing apoptosis.
       Key words:Polysaccharide from Scolopendra subspinipes mutilans;  Cell cycle;  Cell apoptosis
       
       少棘蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch又名百足, 属节肢动物门，多足纲，唇足目，螟蚣科动物，为《中国药典》记载的正品药材，为我国传统的镇痉、通络类药物。祖国医学记载和临床实践均已证明其具有镇静熄风、通络止痛、解毒散结等药用功效［1］。现代药理实验也证明了蜈蚣具有抗肿瘤和抗动脉粥样硬化等作用［2,3］，临床用于治疗肿瘤以及心脑血管病等症。传统中药均以整虫入药，但蜈蚣体内成分复杂，且有效成分尚不明了，无法对其药理作用做进一步研究。为了探讨蜈蚣抗肿瘤作用，本文以少棘蜈蚣为原料，对其体内多糖进行了分离纯化，并进一步对其进行了Hela细胞增殖的作用的研究，为进一步探索蜈蚣抑瘤作用机制奠定基础。
       1 材料
       1.1 材料
       少棘蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch购自汕头市恒青药店，由广东工业大学生药研究室对其进行种类鉴定。人宫颈癌Hela细胞，由汕头大学医学院分子病理实验室提供，微血管内皮细胞MVEC，由汕头大学多学科研究中心提供。
       1.2 试剂与仪器
       DEAE-52为 Whantman 公司产品；1640培养基、胰蛋白酶、噻唑兰（MTT）、碘化丙啶（PI）均购自Sigma公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司；新生牛血清购自杭州四季青生物有限公司。Thermo Labsystems酶标仪（Thermo公司）；Shel Lab二氧化碳培养箱； EpicsXL 流式细胞仪（Backman Coulter公司）；倒置显微镜、荧光显微镜（Olympus公司）；Nikon Coolpix 4500数码相机。
       2 方法
       2.1 蜈蚣多糖(polysaccharides from Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch, SSP)的制备少棘蜈蚣87 g 研钵磨碎，加入1 000 ml蒸馏水90℃恒温水浴搅拌4 h，过滤，残渣加入500 ml蒸馏水，重复上述步骤，过滤，合并滤液，浓缩滤液。取上清液，加5倍体积95％乙醇4℃静置过夜，离心，去上清液，沉淀用少许蒸馏水溶解。Sevag法去蛋白数次［4］，将去蛋白溶液透析干燥，过DEAE-52离子交换纤维素色谱柱，以0.05，0.1，0.2，0.4和1 mol·L-1 NaCl 进行阶段洗脱，共得到3个糖峰，其中浓度0.05 mol·L-1的NaCl洗脱峰糖含量最高，收集此组分透析干燥，待用。
       2.2 Hela和人微血管内皮细胞 ( Human microvascular endothelial cell,MVEC) 的培养取对数生长期的Hela和MVEC细胞接种于含10％小牛血清的1640培养基中，接种浓度为5×105 个/ml，置37℃，5％CO2 浓度，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24 h。去原培养基，加入含有SSP浓度分别为0，0.5，1，1.5，2，4 μg/ml的维持液（含1.5％小牛血清的1640培养基），置培养箱中继续培养24 h和48 h后进行实验。
       2.3 蜈蚣多糖（SSP）对Hela细胞增殖的影响取对数生长期Hela细胞按上述方法接种于96孔板中，贴壁培养24 h，去原培养基，加入含有0.5，1，1.5，2，4 μg/ml SSP维持液，总体积为200 μl，分别培养24，48 h后取出，每孔加入MTT 20 μl继续孵育4 h，吸去上清，加入200 μl二甲基亚砜，振荡15 min，酶标仪检测570 nm波长下各孔吸光值（A），按下列公式计算细胞增殖抑制率。
       
       细胞增殖的抑制率（%）＝（1－实验组A值/对照组A值）×100％
       
       取MVEC细胞作为正常细胞对照，实验方法同上。
       2.4 蜈蚣多糖（SSP）对Hela细胞周期的影响取对数生长期Hela细胞，接种到50 ml培养瓶中，按上述方法培养，贴壁培养24 h后取出，加入含有SSP浓度分别为0.5，1，1.5 μg/ml 维持液中，培养24，48 h后常规消化收集细胞，用PBS清洗3次，加入70％预冷乙醇4℃固定过夜，离心去乙醇，用PBS清洗两次， R NaseA（50 μg/ml）37 ℃消化30 min，PI染色后上机检测细胞周期变化［5］。
       2.5 蜈蚣多糖对（SSP）Hela细胞凋亡的影响将盖玻片切成4块，加入12孔板中，取100 μl 5×104个/ml的细胞悬液加到玻片上，4 h后待细胞贴壁后再加入900 μl培养基，继续贴壁培养20 h。去掉原培养液，用PBS清洗3次后，加入含0.5，1，1.5 μg/ml SSP维持液，24 h后，将玻片取出放入AnnexinV-FITC/PI染液中染色15 min，荧光显微镜下观察并拍照［6］。
       2.6 统计学方法实验所得数据均表示±s的形式, 数据用SPSS 11.0软件统计，不同浓度处理组之间进行t检验，当P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
       3 结果
       3.1 蜈蚣多糖（SSP）对肿瘤细胞增殖的影响
       见表1～2。实验结果表明，在一定剂量范围内SSP对Hela细胞增殖有抑制作用。由表1所示，作用24 h时， 0.5，1，1.5和2 μg/ml SSP对Hela细胞增殖有明显抑制作用；而SSP为4 μg/ml时，对Hela细胞增殖有促进作用；作用48 h时，0.5，1和1.5 μg/ml SSP对Hela细胞增殖有一定抑制作用，2和4 μg/ml SSP对Hela细胞有促进作用。表明SSP在24 h内对Hela细胞抑制作用较强，且在低剂量下抑制作用明显。表1  SSP对Hela细胞的影响（略）
        表2为同样条件下SSP对正常细胞MVEC增殖的影响。作用24 h时，0.5，1，1.5 μg/ml SSP对MVEC细胞增殖抑制作用不明显；作用48 h，各剂量SSP对MVEC细胞均具有促进增殖作用。说明SSP对肿瘤细胞的抑制作用较正常细胞明显。表2  SSP对MVEC细胞的影响（略）
       3.2 蜈蚣多糖（SSP）对Hela细胞周期的影响 流式细胞仪检测结果显示，作用24 h时，各剂量SSP组G2/M期细胞所占比例均明显多于对照组，但各剂量SSP处理48 h时各时相细胞所占比率与对照组比较差异不显著。说明在24 h范围内SSP对Hela细胞作用显著。表3  SSP对Hela细胞周期的影响（略）
       3.3 蜈蚣多糖（SSP）对Hela细胞凋亡的影响
       细胞凋亡早期细胞膜上发生PS（磷脂酰丝氨酸）外翻，标记了FITC的AnnexinV能与PS外翻的细胞结合产生绿色荧光，PI可以透过凋亡晚期细胞或死亡细胞的细胞膜，使其细胞核染成红色。实验结果（见图1），空白对照组仅有少量细胞着绿色荧光，说明PS外翻很少，细胞没有出现凋亡的特征。而3个SSP处理组均有较多细胞着绿色荧光和少量细胞着红色荧光，说明细胞PS外翻严重，均发生了一定程度的细胞凋亡和死亡。
       4 讨论
        已有资料报道蜈蚣油性提取物能够抑制肝癌细胞的增殖［7］，蜈蚣含有类组胺物质的组织提取物对胃癌、肝癌细胞有抑制作用［8］，而对SSP组分抑制肿瘤的研究目前尚未见有报道。
       
       细胞增殖实验结果显示，SSP对Hela细胞增殖有明显抑制作用。为进一步阐明SSP抑制Hela细胞增殖的机制，我们从细胞周期角度深入研究。 由流式细胞仪检测结果显示，SSP可使G0/G1 和S期细胞减少，而G2/M期细胞增多，提示SSP可改变Hela细胞增殖生长周期，使细胞停滞于G2/M期，抑制细胞周期进程。
       
       凋亡是细胞固有的主动消亡过程，在维持组织稳态中起着极重要的作用，细胞凋亡受阻是导致肿瘤发病和耐药的主要病理学基础之一，肿瘤细胞周期的改变通常和细胞的凋亡有关，AnnexinV-FITC/PI双荧光染色检测结果显示SSP可使Hela细胞的凋亡增加，显示了SSP诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
        MTT法检测细胞增殖和流式细胞术检测细胞周期均显示SSP对Hela细胞的影响，在药物处理24 h较48 h效果明显，说明SSP对Hela细胞的有效作用时间短；SSP对Hela细胞的抑制作用浓度仅在一定范围内其作用（1.5 μg/ml左右），浓度过高会促进细胞增殖，其机理目前尚不清楚，有待于进一步实验证明。
       【参考文献】
         　　［1］王贤纯.蜈蚣的药用研究进展［J］.动物学杂志, 2002,37(3): 88.
       
       ［2］周永芹, 韩莉.中药蜈蚣的研究进展［J］.中药材, 2008,31(2): 315.
       
       ［3］张艳慧,司秋菊,王鑫国.蜈蚣抗家兔动脉粥样硬化的实验研究［J］.中药药理与临床，2005，21(1):26.
       
       ［4］董英, 张艳芳, 孙艳辉.水飞蓟粗多糖脱蛋白方法的比较［J］.食品科学, 2007, 28(12):82.
       
       ［5］Bowen W P, Cytometry M. A high throughput approach to cell cycle analysis［J］.Microscopy, 2005，1:1.
       
       ［6］李兴暖, 韩雅莉.地鳖虫纤溶活性蛋白组分抑制血管的生成［J］.动物学报, 2007, 53(1): 135.
       
       ［7］刘国清, 田秉漳, 皮执民, 等. 蜈蚣油性提取物液对肝癌细胞增殖的影响［J］.中国现代医学杂志, 2002, 12(4): 55.
       
       ［8］曲爱兵, 赵维诚, 粱良, 等.蜈蚣组织提取物抗肿瘤活性的初步研究［J］.实用肿瘤学杂志,2003,17(1): 29.