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       【摘要】 
       目的观察栀子浸膏对Hulth法复制兔膝骨关节炎模型中软骨的病理改变及关节液中白细胞介素-1β（IL-1β）的影响。方法24只大白兔随机分为给药组，模型组和对照组，每组8只。给药组，模型组行Hulth术法复制骨关节炎模型，术后第5周，给药组以栀子浸膏600 mg/kg灌胃，模型组与对照组给予等量生理盐水灌胃，给药3周后行软骨Pelletier JP与Mankin"s评分，取股骨内侧髁约0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm组织块行电镜观察软骨细胞形态及检测关节液中IL-1β的含量。结果栀子浸膏能减轻关节软骨病理损伤，给药组关节液中IL-1β的含量明显低于模型对照组(P<0.05)。结论栀子浸膏可减少骨关节炎模型关节液IL-1β的含量和保护关节软骨的作用。
       【关键词】  骨性关节炎; 栀子；关节软骨
       骨关节炎（Osteoarthritis, OA）的发病机制尚未完全阐明，但有关软骨降解的机制已得到深入研究，目前认为白细胞介素-1β（IL-1β）参与了这一过程，它促使软骨细胞、基质的降解以及滑膜炎的形成［1］。栀子系茜草科植物的成熟果实，有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒功效。用于热病心烦,黄疸尿赤,血淋涩痛,血热吐衄,目赤肿痛,火毒疮疡; 外治扭挫伤痛等［1,2］。通过研究栀子浸膏对实验性骨关节炎的影响，本实验观察了栀子浸膏对兔膝OA模型关节液IL-1β及软骨细胞形态的影响。
       1  材料与仪器
       1.1  动物
       大耳白兔24只，3～4月龄，体重2.0～2.5 kg, 雌雄各半，由武汉市万千佳禾实验动物养殖有限公司提供。 
       1.2 药物生栀子浸膏的制备：取成熟生栀子果仁3 000 g（宜昌众生药业公司中药饮片厂生产）,用75%乙醇提取后浓缩得粘稠浸膏436 g(6.88 g生药/g浸膏)；青霉素，华北制药股份有限公司；氯胺酮，福建古田药业有限公司。
       1.3 试剂IL-1β试剂盒为TBD生物发展中心产品。
       1.4 仪器OLYMPUS 光学显微镜，日本奥林巴斯公司生产；RM2315切片机，德国Leica 公司生产；电子显微镜，日本日立公司生产。
       2 方法
       2.1 模型的制备、分组及给药
       将24只白兔随机分为给药组、模型组和对照组，每组8只。氯胺酮（10 mg/kg）麻醉后，给药组、模型组行单侧Hulth术，即取膝关节内侧长约4 cm 的纵切口,探查关节腔内无原发病变后切断内侧副韧带、前后交叉韧带;并完整切除内侧半月板,注意勿损伤关节软骨面,彻底止血,冲洗关节腔,行抽屉实验阳性后,逐层缝合关节囊,皮肤,无菌敷料包扎伤处,不予固定；对照组仅打开关节腔,不损伤韧带和半月板,缝合皮肤,无菌敷料包扎伤处。术后每天肌肉注射青霉素40万U,伤口换药,连续7 d 预防感染。根据临床上超疲劳活动容易提前出现骨关节炎的发病特点［3］,手术1周 后,每天强迫动物活动30 min ,分2 次驱赶,4周后即可获得稳定的OA 模型。术后第5周开始栀子浸膏组给予栀子浸膏600 mg/kg灌胃，模型组和对照组分别给予等量生理盐水灌胃，给药3周。
       2.2 样本取材及实验指标的检测
       ①在患侧关节处脱毛，消毒后用装有1 ml生理盐水注射器行关节腔穿刺，将1 ml生理盐水注入关节腔，反复冲洗后抽出，盛于2 ml离心管中，3 000 r/min, 离心10 min，取上清，按试剂盒方法检测IL-1β含量。②沿原切口切至关节腔行大体(肉眼) 观察后,以锐利刀片切取股骨内髁软骨,置于10 %甲醛中固定,系列脱水、脱钙,常规石蜡包埋,切片,HE 染色,以备光镜观察(大体Pelletier JP评分及光镜下Markin"s 评分［4］)。③取股骨内髁关节软骨修成1 mm ×1 mm ×1 mm 的全软骨层,分别以3%戊二醛固定8 h后置于缓冲液中,再以锇酸固定、脱水,环氧树脂包埋,纵向超薄切片经电子染色后备电镜观察。
       2.3 统计学分析
       数据均以 ±s表示，大体评分用秩和检验,其余组间比较用t检验。
       3 结果
       3.1 大体观察
       按以下原则评分:关节面光整,色泽如常，为0 分;关节面粗糙,有小的裂隙且色泽灰暗，为1分;关节面糜烂,软骨缺损深达软骨表中层，为2分;关节面溃疡形成,缺损深达软骨深层，为3分;软骨剥脱,软骨下骨质暴露，为4分［4］。给药组软骨改变以糜烂粗糙为主,部位集中在股骨内髁内侧,其中2 例出现了内髁内侧缘纤维软骨增生。模型组软骨改变仍集中在股骨内髁关节面,以溃疡形成为主,且内髁内侧缘纤维软骨增生更加明显,其中2 例出现软骨剥脱。对照组软骨表面没有明显改变。表1示给药3周后解剖显微镜下软骨OA 评分,说明给药组软骨退变明显轻于模型组(P< 0.01) 。表1  给药3周后解剖显微镜下软骨OA不同评分例数（略）
       3.2 光镜观察给药组软骨表中层细胞数弥漫性增多,并出现簇集样细胞团,部分标本软骨表面出现裂隙及深达中层的糜烂,可见潮线紊乱（见图1）。模型组大部分软骨表面出现溃烂缺损,软骨细胞则明显减少,多见坏死崩解细胞,潮线紊乱甚至消失（见图2）。对照组软骨表面光镜下没有明显改变（见图3）。给药3周后给药组软骨Mankin′s 评分（438±109） 明显低于模型组软骨Mankin′s 评分（985±212）,两者之间差异有显著性(P<0.01)。对照组软骨Mankin′s 评分（52±14），与模型组间有显著差异(P< 0.01)。
       3.3 透射电镜观察关节软骨超微结构改变对照组对照组软骨细胞核呈卵圆形,细胞表面有细长突起,胞体及胞膜完整,胞浆内可见丰富的细胞器,核内染色质分布均匀,细胞内有大量粗面内质网,基质中胶原纤维排列整齐(见图4) ; 模型组软骨细胞明显固缩、部分溶解坏死,外形不规则,细胞周晕消失,核膜不明显,表面微绒毛突起减少,胞浆内细胞器凝成高电子密度的片状物不易分辨,可见数个脂滴存在(见图5);给药组软骨细胞的各种细胞器丰富,细胞核形态正常,胞质丰富,染色质较均匀,细胞表面突起基本消失,细胞内有大量粗面内质网,胞浆中有空泡出现,细胞周围胶原纤维部分断裂（见图6）。
       3.4 各组关节液IL-1β检测结果给药3周后，模型组关节液IL-1β平均水平(3.04±0.83）ng/ml明显高于给药组（1.98±0.93） ng/ml与对照组（1.75±0.76）ng/ml（P<0. 05)。
       4 讨论
        本实验采用Hulth法复制动物OA模型,通过改变膝关节生物力学状态以诱导关节软骨退变,建立骨关节炎模型。本实验造模后8周时见软骨表面碎裂、剥脱,滑膜增生、粘连,软骨细胞簇集和坏死,说明软骨已有明显的组织形态学改变,并已处于骨关节炎中期和晚期之间,证实了这一方法确能导致骨关节炎的形成,与文献报道相符合。模型组家兔患侧关节液中IL-1β含量明显高于对照组，且软骨细胞的破坏程度亦较对照组强，说明造模是成功的。实验结果显示:给药组软骨在病理程度上的改变明显较模型组为轻,软骨结构较完整,软骨细胞形态改变较小。这些都表明栀子浸膏在一定程度上保护了软骨细胞,维持了软骨结构的相对完整,对软骨细胞的退变和软骨细胞的降解起了一定的缓解作用。
       
       IL-1是最经典的炎症调节剂, 是调节炎症的始终因素。早在20世纪70 年代, Howell等在体外培养巨噬细胞时就发现其上清液能促进软骨的降解, 并促进软骨细胞分泌金属蛋白酶。有学者报道培养膝关节滑膜细胞后, 其上清液IL-1 主要以IL-1β为主［5］。炎症情况下, 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( GM-CSF) 水平升高, 它也能促进IL-1的上调作用, 增加IL-1β的合成，它能促进软骨和滑膜组织金属蛋白酶的表达,包括基质溶酶、胶原酶、组织纤维蛋白溶酶激活剂等; 能抑制软骨细胞Ⅱ型前胶原mRNA 的表达、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成, 具有骨吸收作用。IL-1β可诱发以单核细胞纤维渗出为特征的慢性滑膜炎, 软骨基质降解产物的刺激也可引起滑膜的继发炎症。IL-1β还可促进软骨细胞分泌PGE2 , PGE2参与关节炎症反应, 刺激骨吸收, 并可刺激成骨细胞样细胞增殖, 导致关节骨、软骨增生性变化［6］, 软骨下骨增厚, 边缘长出新骨形成骨赘。IL-1β通过IL-6 介导抑制软骨糖蛋白的合成, 促进成纤维细胞合成和基质微分子的降解, 加重软骨的损伤。关节内局部高水平的IL-6 可能与其影响软骨细胞增殖、软骨损伤的反应性和增强关节炎性反应有关。另外, IL-6 是促进B 淋巴细胞增殖、分化产生抗体的必需因子, 当水平升高时, 会增强机体对软骨等组织的自身免疫应答, 加重软骨的退变。本实验结果显示给药组关节液中IL-1β的含量较模型组显著降低，软骨细胞破坏程度明显减轻，说明栀子浸膏可通降低关节液中IL-1β的含量，而达到保护关节软骨免遭损伤的作用。
       
       目前尚无有效的防治OA的方法,因为很少有药物能改变OA进程。我们的研究表明栀子浸膏能明显明显延缓软骨退变的进程，可起到保护软骨细胞的作用。因此我们认为栀子有可能成为治疗OA有效药物,值得临床进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］朱江, 蔡德海, 芮菁. 栀子的抗炎镇痛作用［J］.中草药, 2000, 31(3): 198.
       
       ［2］王本祥. 现代中药药理学［M］.天津: 天津科技出版社, 1997:292.
       
       ［3］李忆农. 细胞因子与骨关节炎［J］.中华风湿病杂志, 2000, 2(1): 571.
       
       ［4］Pelletier JP, Jovanovic D, Fernandes JC, et al. Reduced progression of experimental osteoarthritis in vivo by selective inhibition of inducible nitric oxide synthase［J］.Arthritis Rheum, 1998, 41: 1275.
       
       ［5］Pelletier JP, Mccollum R, Cloutier JM, et al. synthesis of metalloproteases and interleukin-6 (IL-6) in human osteoarthritis synovia membrance is an IL-1 mediated process ［J］.Rheumatol, 2002, 43(Suppl): 109.
       
       ［6］邓廉夫. IL-1 、TNF-α和IL-6 与骨关节炎 ［J］.国外医学·创伤与外科基本问题分册, 2003, 17(2): 102.