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       【摘要】 
       目的探讨何首乌饮抗大鼠卵巢组织衰老的机理，为抗女性性腺的衰老研究提供理论指导和实验依据。方法将60只SD大鼠随机分为3组：正常组、模型组、预防组。采用D-半乳糖连续腹腔注射法制造雌性大鼠亚急性衰老模型，预防组在造模的同时以中药方剂何首乌饮灌胃。应用原位杂交方法检测各组大鼠卵巢组织胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）蛋白的表达，用RT-PCR方法检测各组大鼠卵巢组织胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）基因的表达情况。结果何首乌饮明显抑制了衰老大鼠卵巢组织中IGFBP3基因表达的上调趋势（P＜0.05），且明显提高了衰老大鼠卵巢组织中IGF-Ⅰ蛋白的表达（P＜0.05）。结论何首乌饮通过影响衰老大鼠卵巢中细胞因子IGF-Ⅰ、IGFBP3的表达，起到抗大鼠性腺衰老的作用。
       【关键词】  何首乌饮；衰老；大鼠；胰岛素样生长因子Ⅰ；胰岛素样生长因子结合蛋白3；RT-PCR；原位杂交
       Effect of Traditional Chinese Medicine Heshouwuyin on the Expression of IGF-1 and IGFBP3 in the Ovary of the Aging Model Rats
       ZHANG Na, LI Yali, GAO Fulu
       1.Department of Reproductive Medicine, The Forth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, 050011, China; 2.The People"s Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang, 050071, China; 3.Hebei Normal University, Shijiazhuang  050017, China
       Abstract：ObjectiveTo study the mechanism of traditional Chinese medicine Heshouwuyin(HSWY) in anti-aging of the aging model rat ovary, so as to provide the oretical and experimental evidence to anti-aging in the female sexual gland.Methods60 rats were divided into three groups at random: normal group, aging model group, treatment group. The rats in treatment group were redivided into four groups: HSWY low dosage group, HSWY middle dosage group, HSWY high dosage group and Heshouwan(HSWW) group. The sub-acute aging model rats were induced by D-galactose, and the rats in treatment group were administered intragastricaug with HSWY and HSWW.The gene expression of insulin growth factor banding protein 3(IGFBP3) in ovary of each group was detected reverse transcription polymerase chain reaction, and the protein expression of insulin growth factor-1(IGF-1) was examined by the method of in-situ hybridization.　ResultsThe gene expression of IGFBP3 was up-regulated and the protein expression of IGF-1 were inhibited in ovaries of aging rats. HSWY significantly suppressed the gene expression of IGFBP3(P＜0.01) and increased the protein expression of IGF-1(P＜0.01).　ConclusionHSWY has anti-aging effect on rat sexual gland through regalating the expression of cytokines such as IGF-1 and IGFBP3 in ovary.
       Key words：Heshouwuyin (HSWY); Aging; Rats; IGF-Ⅰ; IGFBP3; RT-PCR; In-situ hybridization
       
       围绝经期是妇女从性成熟期过渡到老年期的一个必经的生理过程。在这一时期，卵巢机能活动的衰减是最为直接的表现。如何延缓卵巢的衰老，提高围绝经期妇女的生活质量已成为研究热点。传统中医学认为肾虚是衰老的主要原因。何首乌饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成，具有补肝肾、益精血、延年益寿之功效。本研究应用D-半乳糖连续腹腔注射法制造雌性大鼠亚急性衰老模型，以大鼠卵巢为研究对象，应用原位杂交、RT-PCR方法检测并分析应用何首乌饮对衰老大鼠卵巢组织胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）、胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）表达的影响，探讨何首乌饮在细胞因子水平抗大鼠卵巢衰老的作用机制。
       1 材料与方法
       1.1 动物
       选用8周龄清洁级SD雌性大鼠（由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证编号605106）60只，随机分为正常组、模型组、预防组。预防组又分为何首乌饮低剂量组、何首乌饮中剂量组、何首乌饮高剂量组、何首乌丸组。每组动物各10只。
       1.2 药物　
       何首乌饮组成：何首乌（炙）、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊藿、丹参、茯苓，各药用量比例为3∶2∶3∶2∶5∶3。何首乌丸组成：何首乌、肉苁蓉、怀牛膝，各药用量比例为3∶2∶3。两药分别加5倍蒸馏水浸泡2 h，文火煮沸30 min，滤过。药渣再加3倍量水继续煎煮20 min，滤过。两次滤液混和，水浴浓缩至520 ml，4℃低温保存备用。所制的何首乌丸含生药1.1 kg/L，低剂量何首乌饮含生药2.4 kg/L，中剂量何首乌饮含生药4.8 kg/L，高剂量何首乌饮含生药9.6 kg/L。
       1.3 模型的建立及各组动物的处理
       用生理盐水将D-半乳糖配成6%的溶液，按300 mg/(kg·d)进行腹腔注射，连续用药60 d，从而建立亚急性衰老大鼠模型。预防组在腹腔注射D-半乳糖的同时给药何首乌饮或何首乌丸，每组均按4 ml/(kg·d)灌胃给药，连续用药60 d。同期正常组腹腔注射以及灌胃同量的生理盐水，1次/d。
       1.4 标本的采集及处理
       连续用药60 d后，每组随机抽取5只大鼠，在3%戊巴比妥麻醉下开胸，经左心室快速灌注生理盐水250 ml后，再灌注含0.1%DEPC的4%多聚甲醛250 ml，1h内灌流完毕。然后取卵巢，再以含0.1%DEPC的4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，以备用作原位杂交检测。余下5只大鼠以断颈法处死，迅速取出卵巢组织，置于液氮中保存备用。
       1.5 原位杂交（in-situ hybridization）
       1.5.1 IGF-Ⅰ探针合成序列由天津灏洋生物制品科技有限公司提供。
       
       上游引物5"-GTCGTCTTCACATCTCTTCTACCTGGCACTC3"
       
       下游引物5"GAGAGCCAGGTAGAAGAGATGTGAAGACGAC3"
       1.5.2 检测方法
       石蜡包块连续切片，切片脱蜡至水，置打孔液中室温10 min，使探针快速穿透细胞膜。0.1M PBS冲洗，3次。3.3%H2O2 1份+蒸馏水10份混合，室温5 min灭活内源性酶。0.1M PBS冲洗，3次。暴露mRNA核酸片断：切片上滴加复合消化工作液，37℃消化20 min，0.1M PBS冲洗，3次，室温0.2×SSC洗涤3 min，1次。后固定：含有1∶1000 DEPC的 1%多聚甲醛室温固定10 min，蒸馏水冲洗3次。预杂交：每张切片加预杂交液20 μl，恒温37℃ 1.5 h。室温0.2×SSC洗涤5 min，3次。杂交：每张切片加杂交液20 μl，恒温37℃杂交3 h。杂交后洗涤： 37℃ 2×SSC洗涤5 min，3次，37℃ 0.2×SSC洗涤5 min，3次，37℃ 0.1 mol TBS洗涤5 min，4次。滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃ 45 min，0.1M PBS冲洗5 min，3次。滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合物工作液，37℃ 45 min，0.1M PBS冲洗5 min，3次。DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片。
       1.5.3 结果判定
       以PBS替代一抗作为阴性对照，以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性结果。每组选5只动物的组织，每个标本取3张切片，光镜下放大400×，随机选取组织结构比较完整的部位，通过光学显微镜和Motic 6.0 数据医学图像分析系统测定每张切片中10个视野阳性细胞的平均光密度（MOD）值，并计算其平均值，代表IGF-Ⅰ mRNA的表达。
       1.6 RT-PCR
       1.6.1 卵巢组织总RNA的提取将卵巢组织从液氮中取出，剪碎后置匀浆套管中，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA，并以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度。
       1.6.2 引物的设计及合成由上海生工生物工程技术服务有限公司提供，见表1。表1  RT-PCR分析的引物（略）
       1.6.3 PCR过程以总RNA为模板，以Oligo(dT)16为引物，按反转录酶AMV（Promega）说明书反转录合成cDNA。以cDNA为模板，加入IGFBP3 cDNA上、下游引物，以β-actin为内参照，进行PCR。PCR扩增反应体系：取5 μl反转录产物作为PCR反应模板，依次加入dNTPs混合物（终浓度0.2 mmol/L），MgCl2 2.5 mmol/L，上、下游引物（终浓度50 pmol/L），10×PCR缓冲液2.5 μl，Taq DNA聚合酶2 U，加无菌去离子水至总体积25 μl，置PCR仪上进行扩增。设定反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环后，72℃延伸7 min。最后取10 μl PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，运用凝胶成像系统对条带进行吸光光度值分析。以IGFBP3/β-actin平均吸光度比值分别表示IGFBP3的mRNA水平，进行半定量分析。
       1.7 统计学处理实验结果
       采用±s表示，组间资料应用多因素方差分析，各项统计均用SPSS 11.5软件在计算机上完成。
       2 结果
       2.1 原位杂交结果IGF-Ⅰ mRNA阳性细胞主要为卵巢泡膜细胞、间质细胞和黄体细胞，颗粒细胞未见IGF-Ⅰ mRNA的表达。与正常大鼠相比，衰老模型大鼠卵巢组织中IGF-Ⅰ mRNA表达明显降低（P＜0.01），给予不同剂量的何首乌饮及何首乌丸预处理后，IGF-Ⅰ mRNA表达显著升高（P＜0.01），预防组间未见明显差异（P＞0.05）（图1及表2）。表2  IGF-Ⅰ mRNA在大鼠卵巢组织中表达水平的分析结果（略）
       2.2 PCR结果衰老模型大鼠卵巢组织IGFBP3基因表达上调，在正常组大鼠卵巢组织中，IGFBP3表达较低，D-半乳糖造模后，IGFBP3表达明显升高（P＜0.01）；而给予不同剂量的何首乌饮和何首乌丸预处理后，与模型组相比，IGFBP3基因表达均明显降低（P＜0.05）（图2及表3）
       表3  IGFBP3基因mRNA在大鼠卵巢组织中转录水平的分析结果（略）
       3讨论
          
       祖国医学认为精气虚弱是导致机体衰老的主要原因。肾为先天之本，肾藏精，其精气是构成人体和促进人体生长发育的基本物质，所以历代医家多用补肾为主的方药来延年益寿。本研究所用何首乌饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成。何首乌丸本由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝组成，能填精补髓、乌发延年，于此基础上加淫羊藿补肾壮阳以强筋骨，丹参活血化瘀以通心脉，茯苓健脾利湿以宁心神。诸药相配通调心脾肝肾四脏，而以肾为主，起到补肾益髓等功效。
       
       IGF-Ⅰ是卵巢局部调节系统中重要的生长因子［1，2］，以自分泌、旁分泌形式参与调节卵泡膜细胞和颗粒细胞的下列功能：DNA合成、甾体激素生成、芳香化酶活性、LH受体生成和抑制素分泌等。在人卵巢细胞中，IGF-Ⅰ和FSH共同促进蛋白质和甾体激素生成。IGF-Ⅰ增强促性腺激素的作用，并协调卵泡膜细胞和颗粒细胞的功能。IGF-Ⅰ与FSH的协同作用，强烈地促进排卵前卵泡的芳香化酶活性，从而明显促进雌激素的生成。
        有资料证实IGFBP可能作为IGF的抑制剂与卵泡发育受阻有关［3］。IGFBP-3不仅通过内分泌更主要是通过自分泌和旁分泌方式对卵泡的形成及发育起着重要作用。Wang等［4］发现卵泡液中IGFBP-3浓度在健康卵泡发育中逐渐下降，与Amato［5］研究结果一致，他们发现卵巢功能正常者自然周期晚卵泡期血清IGFBP-3水平明显低于早卵泡期水平，超促排卵治疗后血清IGFBP-3水平也明显低于治疗前水平。
        有研究显示，增龄及卵巢去势均可使血液中IGF-Ⅰ浓度降低［6，7］。本研究原位杂交结果显示，IGF-ⅠmRNA在衰老大鼠卵巢中表达减弱，这与先前学者研究相一致，衰老使IGF-Ⅰ分泌减少。应用何首乌饮增加了大鼠卵巢中IGF-ⅠmRNA的表达水平，起到抗卵巢衰老的作用。
       
       本研究PCR结果显示，在衰老大鼠卵巢中IGFBP3的表达明显高于正常大鼠，说明在衰老大鼠卵巢中成熟卵泡发育减少。而预防性给予何首乌饮后，大鼠卵巢中IGFBP3的表达降低，由此推测，何首乌饮通过降低IGFBP3的水平，进而间接增加了IGF-Ⅰ的表达，使卵巢的功能恢复。而这与原位杂交结果相吻合，进一步说明何首乌饮同时对IGF-Ⅰ及其结合蛋白IGFBP3发挥作用，起到抗卵巢衰老的作用。
       【参考文献】
         　　［1］夏天, 沈嵘, 侯莉莉, 等. 补肾调冲方对大鼠卵巢颗粒细胞增殖与分泌及其IGF-1 mRNA表达的影响［J］. 辽宁中医杂志, 2006，33(9): 1084.
       
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       ［4］Wang TH, Chang CL, Wu HM, et al. Insulin-like growth factor-II (IGF-II), IGF-binding protein-3 (IGFBP-3), and IGFBP-4 in follicular fluid are associated with oocyte maturation and embryo development［J］. Fertil Steril, 2006， 86(5): 1392.
       
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       ［6］Giovannini S, Marzetti E, Borst SE, et al. Modulation of GH/IGF-1 axis: Potential strategies to counteract sarcopenia in older adults［J］. Mech Ageing Dev, 2008，129(10): 593.
       
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