文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的从万寿菊花萃取物的皂化产物中分离、纯化制备高纯度叶黄素。方法万寿菊干花颗粒经超临界CO2萃取得到万寿菊花萃取物，加碱皂化的产物用水稀释后，用二氯甲烷从中萃取叶黄素，在分出的水相中加入氯化钙，分离出被分散在水相的叶黄素，蒸馏溶剂后用醋酸乙酯与石油醚的混合溶剂洗涤，再用无水乙醇洗涤，制得高纯度叶黄素。结果实验确定了加水量为皂化产物的4倍；二氯甲烷用量为水与皂化产物的和；醋酸乙酯与石油醚的体积比为1∶4，用量为分离产物的3倍。结论此法制得的叶黄素纯度高，色泽纯正，工艺简单。
       【关键词】  万寿菊；叶黄素；分离；纯化
       叶黄素是天然抗氧化剂，具有良好的抵御游离基在人体内造成的细胞与器官损伤的能力［1］,可用于防治由于机体衰老引发的冠心病、心血管硬化［2］和肿瘤等疾病。另外，叶黄素是眼中含有的仅有的两种类胡萝卜素之一，预防和治疗老年性眼球视网膜黄斑区病变［3］、白内障等眼部疾病是叶黄素的独特功能。不仅如此，叶黄素着色能力强，又富有营养，是优良的食品着色剂和动物饲料添加剂［4］,因此，叶黄素被广泛应用于医药、保健品、化妆品、食品、动物饲料、水产、烟草等行业［1］。万寿菊中的反式叶黄素酯的含量很高，而其他类胡萝卜素的含量较少，是非常好的叶黄素来源。本研究从叶黄素浸膏皂化产物中萃取分离、纯化制备高纯度叶黄素的工艺条件，以期为规模制备高纯度叶黄素提供参考。
       1  材料与仪器
        
       万寿菊干花颗粒由大同市天然色素有限公司提供；叶黄素标准样品，由万寿菊干花经超临界CO2萃取制备出浸膏，经皂化、分离和纯化处理制得,经天然产物标准样品国家核心实验室（北京）分析鉴定含量为97.29%。
       
       HA121-50-01-C超临界萃取装置（采用一萃二分流程）由江苏南通华安超临界萃取有限公司制造；LC5500型高效液相色谱仪由北京东西电子技术研究所制造；ME211 型超声波清洗器，美国Metter Electronics 公司生产; Millipore 膜过滤器及真空泵, 美国Waters 公司生产； DF-20型流水式中药粉碎机，由无锡中银机械制造有限公司制造。CO2，由太原天计应用化工有限公司生产，食品级，纯度在99%以上；万寿菊萃取物由万寿菊干花颗粒经超临界CO2萃取制得；皂化、分离与纯化所用试剂均为分析纯，由天津精细化工开发中心生产；HPLC分析用试剂为分析纯，由北京化工厂生产；水为二次蒸馏水。
       2 方法
       2.1 万寿菊萃取物的制备及皂化
       万寿菊干花颗粒经超临界CO2萃取，得到的萃取物在KOH的醇溶液中皂化反应后，将溶剂蒸馏得到皂化产物。
       2.2 游离叶黄素的分离
       将皂化产物加水稀释后，用二氯甲烷萃取，分出水层，水洗二氯甲烷层至水相无色透明，且为中性。收集萃取与水洗过程中分出的水相，在其中加入足量氯化钙，至水相无色透明，过滤沉淀，用二氯甲烷洗涤沉淀，收集洗液，并用水洗至水相无色透明且为中性。将洗液与萃取所得的二氯甲烷相合并，蒸馏溶剂得到叶黄素粗品。
       2.3 游离叶黄素的纯化
       叶黄素粗品中加入醋酸乙酯与石油醚的混合溶剂洗涤，过滤除去杂质，得到叶黄素结晶体；再用无水乙醇洗涤，得到叶黄素的重结晶体。
       2.4 叶黄素的高效液相色谱分析 
       称取叶黄素样品20.0 mg，用流动相配成8×10-6 g·ml -1的溶液。色谱条件: 色谱柱为Diamonsil C18柱; 甲醇 ∶乙腈∶醋酸乙酯∶水（V∶V∶V∶V）= 30∶29∶40∶1 为流动相; 流速0.75  ml·min-1; 检测波长450 nm; 柱温25 ℃; 进样量20 μl。色谱图见图1。
       3 结果
       3.1 分离过程
       3.1.1 皂化产物稀释过程中的加水量
       加水稀释皂化产物,可以去除其中水溶性杂质,水的用量过大，会使油水界面上的脂肪酸皂浓度增大，容易形成较厚的中间层，要想得到较好的分离效果，必须加大二氯甲烷的用量；而水的用量过小，则会使体系的黏度过大，不利于分离。经实验确定：水的用量为皂化产物脱出溶剂后浓缩物量的4倍。
       3.1.2 萃取分离中二氯甲烷的用量
       皂化生成的脂肪酸皂能使部分二氯甲烷和叶黄素单体分散于水相中，所以二氯甲烷与水的体积比至关重要，太大则造成溶剂浪费，太小则不利于叶黄素单体分离。经实验确定二氯甲烷用量为水与皂化产物脱出溶剂后浓缩物量的和。
       3.1.3 水洗二氯甲烷层中水的用量
       水洗二氯甲烷层要确保滤液呈中性，且无色透明。
       3.1.4 回收水相中分散的叶黄素
       由于皂化生成产物中的脂肪酸皂具有表面活性,使部分叶黄素分散于水相中难以分出,加入氯化钙，形成脂肪酸钙皂悬浮于水的表面，使得叶黄素释放出来，氯化钙加量应使得水相无色透明，过滤悬浮物，二氯甲烷洗涤滤饼，滤液为二氯甲烷的叶黄素溶液。
       3.2 纯化过程
       3.2.1 叶黄素结晶中溶剂的选择
       在结晶纯化过程中要求溶剂对杂质和叶黄素的溶解具有很好的选择性,且毒性要小,安全性好。实验确定了醋酸乙酯与石油醚的混合溶剂，在一定配比和用量下，能够除去与叶黄素结构相似、难以去除的杂质，如隐黄素等。
       3.2.2 混合溶剂的用量
       比15 g万寿菊萃取物经皂化、分离所得的叶黄素粗品用不同配比的醋酸乙酯与石油醚的混合溶剂60 ml洗涤，所得叶黄素晶体经无水乙醇洗涤、40 ℃真空干燥得到叶黄素单体。所得结果如图2（a）。取样品20.0 mg，用流动相配成8×10-6 g·ml-1的溶液，在上述色谱条件下测定叶黄素含量。所得结果如图2（b）。从图中看出，当醋酸乙酯与石油醚体积比为1∶4时，叶黄素的得量与含量均最高。
       3.2.3 混合溶剂用量
       15 g万寿菊萃取物经皂化、分离所得的叶黄素粗品用体积比为1∶4的醋酸乙酯与石油醚的混合溶剂分别用不同用量洗涤，所得叶黄素晶体经无水乙醇洗涤、40 ℃真空干燥得到叶黄素单体。所得结果如图3（a）。取样品20.0 mg，用流动相配成8×10-6 g·ml -1的溶液，在上述色谱条件下测定叶黄素含量。所得结果如图3（b）。
       从图3中看出，叶黄素晶体的得量随着混合溶剂的用量的增加而减少，这主要是由于醋酸乙酯对叶黄素的溶解度较大，使得部分叶黄素溶入混合溶剂,当混合溶剂用量为粗品的3倍（ml/g）时 叶黄素含量最高,说明此时混合溶剂溶剂杂质效果最好。
       3.2.4 叶黄素重结晶   
       用混合溶剂结晶出的叶黄素晶体含有少量极性较强的杂质，用无水乙醇洗涤晶体可以驱除此类杂质，无水乙醇洗涤至滤液无色透明为止。叶黄素在无水乙醇中重结晶后，色泽纯正，纯度可达90%以上。
       3.3 真空干燥
       在40 ℃下真空干燥6 h，得到高纯度叶黄素晶体。
       4 结论
       用二氯甲烷从万寿菊花萃取物的皂化产物中萃取分离叶黄素单体，脂肪酸钾皂使部分叶黄素单体增溶于水相中，很难完全分离，加入氯化钙形成脂肪酸钙皂，释放出叶黄素单体，然后用二氯甲烷溶解这部分叶黄素，可以完全分离叶黄素单体，提高其收率。选用醋酸乙酯与石油醚、无水乙醇纯化叶黄素，此法工艺简单，产品纯度高，色泽纯正，有较高的工业生产应用价值。
       【参考文献】
         　　［1］Alexandra,AR.AndrewS.The science behind lutein［J］.Toxicology Letters，2004，150:57.
       
       ［2］张慧，李涛，徐公世.一种前景广阔的天然食品着色剂—叶黄素［J］.中国食品添加剂，2004，5:45.
       
       ［3］Whitehead, A. J.; Mares, J. A.; Danis, R. P. Macular pigment: a review of current knowledge［J］.Arch. Ophthalmol. 2006, 124：1038.
       
       ［4］孟祥和，毛忠贵，潘秋月.叶黄素的保健功能［J］.中国食品添加剂，2003，1:17.