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       【摘要】 
       目的对藤茶水溶性多糖进行分离纯化得到AGP-3组分，并对其结构进行初步的鉴定，为藤茶多糖结构与生物活性关系的研究奠定基础。方法采用DEAE-Sephadex A-25、Sephadex G-200和HPLC对藤茶多糖分离纯化，并通过IR、GC、1HNMR和13CNMR分析对藤茶多糖AGP-3组分的结构进行了初步鉴定。结果AGP-3重均分子量(Mw)为1.02×105 Da，含中性糖质量分数57.6%、糖醛酸32.3%、蛋白质3.5%。结论藤茶多糖分离组分AGP-3为一种含蛋白质的复合多糖。
       【关键词】  藤茶；多糖；分离纯化；结构鉴定
       Isolation and Purification and Preliminary Structure Identification of Polysaccharide Fraction AGP-3 from Ampelopsis grossedentata
       LUO Zuyou, CHEN Genhong,ZHENG Xiaojiang, WU Moucheng
       1.Key Laboratory of Biological Resources, Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000，China; 2. School of Biological Science and Technology, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000，China; 3. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070，China
       Abstract：ObjectiveTo provide a basis for the research about the relation between the structure and its bioactivities of polysaccharides from Ampelopsis grossedentata. The polysaccharide fraction AGP-3 was obtained and analyzed preliminarily after water-soluble polysaccharides from Ampelopsis grossedentata being isolated and purified.MethodsThe water-soluble polysaccharides from Ampelopsis grossedentata were isolated and purified with DEAE-Sephadex A-25, Sephadex G-200 and HPLC, and the structure of AGP-3 was analyzed preliminarily by IR, GC, 1HNMR and 13CNMR. ResultsThe molecular average-weight (MW) of AGP-3 was 1.02×105 Da, containing 57.6% neutral sugar, 32.3% uronic acid and 3.5% protein.ConclusionThe polysaccharide fraction AGP-3 from Ampelopsis grossedentata is a kind of conjugated polysaccharide containing protein.
       Key words：Ampelopsis grossedentata；  Polysaccharide；Isolation and purification；  Structure identification
       
       藤茶 Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang，属于我国特有的类茶植物，具有悠久的民间药用历史［1］。据记载，藤茶入药性味甘淡、清热解毒，主治黄疸型肝炎等［2］，现代研究证实藤茶富含黄酮等重要的生物活性成分［1，3］。大量研究表明，植物多糖，尤其是从中药材中提取的水溶性多糖，如枸杞多糖、银杏多糖等具有免疫调节、抗氧化、降血糖、抗肿瘤等多种生物活性［4，5］。实验对藤茶水溶性多糖组分AGP-3的提取、分离和结构进行研究，为考察藤茶多糖结构与生物活性的关系奠定基础。
       1  材料与仪器
        藤茶由鄂西藤茶公司提供； DEAE-Sephadex A-25和Sephadex G-200，Pharmacia（USA）产品；牛血清白蛋白，中科院新疆化学所生化试剂厂；葡萄糖醛酸，Sigma产品；多糖标准品为Pullulan系列，日本东京化成公司产品；其它均为国产分析纯试剂。
       
       日本岛津UV-265 FW紫外可见分光光度计；旋转蒸发仪，Buchi RE111，Switzerland；气相色谱分析仪，GC-9A Shimadzu，Japan（浙大智达N2000气相色谱工作站）；高压液相色谱仪（RI检测器），Agilent 1100，USA；红外光谱仪，Thermo Nicolet Nexus FT-IR，USA；核磁共振仪，Mercury 600 NMR，Varian Inc. USA。
       2 方法
       2.1  藤茶多糖的提取、纯化
       工艺路线藤茶→粗粉→石油醚脱脂脱色→残渣→热水提取→浓缩→醇沉→收集沉淀、复溶、醇沉→复溶→Sevag法脱蛋白→冷冻干燥→DEAE-Sephadex A-25柱分离→透析→浓缩→冷冻干燥→Sephadex G-200柱层析纯化→冷冻干燥→藤茶多糖AGP-3。
       2.2 藤茶多糖的提取
       称取一定量的原料粗粉，用石油醚浸泡、回流脱脂脱色，回收残渣，挥干溶剂，以1∶25料水比于95℃水浴提取两次，每次4 h，得到多糖提取液，真空浓缩后，加入浓缩液3倍体积的95%EtOH，静置2 h，收集沉淀-复溶-醇沉，再复溶、Sevag法［6］处理3次，冷冻干燥得到藤茶多糖AGP（polysaccharides from Ampelopsis Grossedentata，AGP）。
       2.3 藤茶多糖的分离与纯化
       称取一定量的藤茶多糖AGP，溶于少量蒸馏水中，上DEAE-Sephadex A-25柱（19 mm×55 cm），以0～0.5 mol·L-1NaCl 溶液阶段洗脱，流速0.5 ml/min，分部收集，10 min/管。硫酸苯酚法和紫外吸收法分别检测多糖（A490）和蛋白质（A280）。合并0.3 mol·L-1  NaCl溶液洗脱的多糖高峰部分，透析脱盐、减压浓缩、冷冻干燥。干燥样品进一步溶于小体积蒸馏水，上Sephadex G-200柱（19 mm×55 cm），蒸馏水洗脱，流速10 ml/h，分部收集，3 ml/管，同上方法跟踪检测多糖和蛋白质。合并多糖高峰部分，浓缩、冷冻干燥得白色絮状固体AGP-3。
       2.4  藤茶多糖的纯度鉴定与理化性质分析
       2.4.1  纯度鉴定［7～9］
       常压凝胶柱层析（Sephadex G-200） 10 mg多糖样品溶于小体积双蒸水中，上Sephadex G-200柱（19    mm×55 cm），用双蒸水洗脱，流速6 ml/h，分部收集，3 ml/管。同上法跟踪检测，并绘制洗脱曲线图。
       
       高效凝胶柱色谱（HPLC） Agilent 1100 HPLC；Plaquagel-OH MIXED 柱；示差检测器；洗脱剂为醋酸盐缓冲液(0.2 mol·L-1 NaAc-0.2 mol·L-1 HAc, pH 6.0)；流速1.0 ml/min；柱温25℃；保留时间 12 min。样品浓度1.0 mg·ml-1，进样50 μl。记录样品色谱曲线。
       2.4.2 基本理化性质［8,9］
       用KI-I2反应检测淀粉，斐林试剂反应检测还原糖，苯酚-硫酸法测定中性糖，硫酸-咔唑反应检测糖醛酸，考马斯亮蓝G-250反应测定蛋白质含量。
       2.5 藤茶多糖的结构分析
       2.5.1 分子量测定 
       HPLC法（同上）。
       2.5.2 单糖组成分析
       采用糖腈乙酰酯衍生物气相色谱法［10］。色谱条件： OV-1701石英毛细管柱（0.32 mm×30 m），内径0.32 μm；N2为载气，流速50 ml/min，分流比为1∶50；氢火焰离子化检测器，H2  0.6 kg/cm2，空气0.5 kg/cm2；进样口温度250℃；柱温为程序升温，0～5 min升为190℃，再以20℃/min的速率升至230℃。
       2.5.3 红外光谱分析
       约20 mg多糖固态样品，通过红外光谱仪采样器直接采样、压片、扫描，记录红外光谱。
       2.5.4 核磁共振1HNMR和13CNMR分析
       多糖样品溶于重水（D2O）中，样品浓度50 mg·ml-1，温度25℃，在Mercury 600 NMR仪上分析其波谱特征。
       3 结果与分析
       3.1 藤茶多糖的分离纯化
       藤茶多糖AGP上 DEAE-Sephadex A-25柱，用不同离子强度的NaCl溶液洗脱，可将吸附于交换剂上的酸性多糖分离出来。收集0.3 mol·L-1NaCl洗脱出的高峰部分，得率28.0%；再经Sephadex G-200凝胶柱纯化，得到分子量相对集中的纯化组分AGP-3，得率67%。
       3.2 纯度鉴定常压凝胶（Sephadex G-200）柱层析
       结果如图1所示。AGP-3洗脱曲线为单一对称峰，洗脱液的A280曲线与多糖A490曲线基本保持一致的变化趋势，说明该多糖组分的分子量分布相对均一，并含有蛋白质。
         
       高效液相色谱法（HPLC）检测AGP-3，结果如图2所示。两种层析检测结果表明，藤茶多糖组分AGP-3为相对均一的多糖。
       3.3 AGP-3的基本性质
       藤茶多糖AGP经两次分离分级纯化得到多糖组分AGP-3，其冷冻干燥产品为白色絮状固体，溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂；KI-I2反应阴性，属非淀粉多糖；不与斐林试剂反应，即不含单糖；苯酚-硫酸反应、硫酸-咔唑反应、考马斯亮蓝G-250反应均呈阳性，表明该多糖含有糖醛酸、蛋白质。经测定，AGP-3含中性糖质量分数57.6%、糖醛酸32.3%、蛋白质3.5%。
       3.4  AGP-3结构的初步分析
       3.4.1 分子量测定
       HPLC测得藤茶多糖组分AGP-3重均分子量(Mw)为1.02×105 Da 。
       3.4.2 气相色谱分析
       GC分析显示，组分AGP-3的主要单糖是：半乳糖、甘露糖，其次是葡萄糖，说明藤茶多糖AGP-3为杂多糖。但GC分析未能检出己糖醛酸，可能是制备糖腈衍生物的过程中己糖醛酸遭到破坏的缘故［11］。
       
       关于GC法分析多糖样品中的单糖组成，具体方法的选择及操作条件的控制极为重要。目前尚未见到关于藤茶多糖研究的相关报道。本结果仅是对藤茶多糖单糖组成的初步分析，更准确、更完善的分析方法有待进一步探索。
       3.4.3 红外光谱分析
       AGP-3的红外光谱如图3所示。主要结构特征：3 700～3 100 cm-1的宽峰是糖类O-H的伸缩振动(νO-H)，存在着分子间和分子内的氢键，也包括有-NH2中N-H的伸缩振动（νN-H），提示多糖中含有-OH、-NH2或-NH基团。1 740～1 680  cm-1是-COOH中C=O的伸缩振动(ν-COOH)。1 605.74  cm-1处为羰基中C=O的伸缩振动（νC=O），也可能包括酰胺基H2N-C=OR中N-H的变角振动。-NH2、-NH基团、酰胺基的存在，表明可能含有蛋白质。1 440～1 395 cm-1是-COOH的C-O的伸缩振动(νC-O)。1 320～1 210 cm-1是-COOH的O-H的变角振动(δO-H)。1 200～1 000 cm-1是-COOH中C-O-H伸缩振动（νC-O-H）和吡喃环的醚键(C-O-C)伸缩振动(νC-O-C)。1 023.23 cm-1是 O-H 的变角振动（δO-H）。974.80 cm-1是糖环的骨架振动；790.64 cm-1是甘露糖苷键的变角振动。820～950 cm-1之间是D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖的特征吸收，包括α-和β-构型吸收峰。这与AGP-3性质和GC分析的结果基本相符。
       3.4.4 核磁共振1HNMR和13CNMR分析
       鉴于以上对藤茶多糖AGP-3的单糖组成、红外光谱分析结果，进一步对AGP-3进行核磁共振分析。AGP-3的1HNMR和13CNMR分析结果如图4、图5所示。
       
       图41HNMR氢谱中，多糖的信号大多数集中在δ 3.0～5.3 ppm狭小的范围内, δ 3.5～4.5 ppm为糖环质子信号。一般α-构型糖苷的异头碳上氢的共振比β-构型糖苷向低场位移0.3～0.5 ppm, α-型吡喃己糖C1位质子的δ值>5.0 ppm, 而β-构型一般δ值< 5.0 ppm［7］。图中AGP-3多糖在δ 5.0 ppm左右两边都有信号,因此, 存在α、β两种糖苷构型。据文献，图中δ1.1～3.6 ppm范围的信号为蛋白质中氨基酸残基的β-H和γ-CH3、-CH2、-CH上的1H化学位移信号［12］。
       
       从图5的13CNMR谱中看出, 异头碳的共振峰均集中在δ98.771～102.692 ppm范围内，清楚呈现3个共振信号，说明该多糖主要由3种不同的单糖残基组成，为杂多糖，且存在α，β两种糖苷构型。图中最低场处δ170.785和174.244 ppm显示有己糖醛酸存在，因为最低场处的信号δ170～176 ppm 反应己糖醛酸中羧基的特征信号［13，14］。除糖醛酸外，GC分析中显示甘露糖、半乳糖和葡萄糖3种单糖组分的糖腈乙酰酯衍生物色谱峰，其中葡萄糖衍生物峰较弱；而13CNMR谱中仅显示3种单糖残基的共振信号，可能是由于葡萄糖残基含量少、其峰较弱被掩盖所致。
       根据葡萄糖中各个碳的化学位移δ C1(102.692)，δ C6(61.895)，可以推测其为β-(1→6)连接，δ C6(69.546)为O-取代后的化学位移值，其余δ 76.077～77.144 ppm为糖环上非连接碳C2，C3，C5的化学位移值。甘露糖各个碳的化学位移δ C1 (101.008)，δ C4(68.864)，δC6(61.895)，可以推测其为β-(1→4), (1→6)连接，其余化学位移δ72.451～78.816 ppm为糖环上非连接碳C2，C3，C5的化学位移值。半乳糖各个碳的化学位移δ C1(98.771)，C2（69.546），C3（70.613），C6（61.895）可推测半乳糖以α-D-(1→6)与甘露糖连接。图谱中δ59.581 ppm和δ52.908  ppm为蛋白质氨基酸残基γ-CH3、-CH2、-CH等的13C信号［12］。AGP-3准确的结构信息，尚需进行GC-MS、多维NMR等相关分析。
       
       IR分析和13CNMR 结果显示，AGP-3中含有较多的己糖醛酸，因为含糖醛酸的多糖样品IR图谱中1 700～1 750 cm-1范围内会产生吸收, 13CNMR 图谱中在低场176 ppm附近会有羰基碳的特征吸收，而当糖醛酸残基含量较少时IR谱中1700～1750 cm-1的吸收峰被掩盖［15］。这与对AGP-3的基本性质分析结果一致。
       4  结论与讨论
       4.1  首次对藤茶水溶性多糖进行分离、纯化
       获得多糖组分AGP-3以热水提取、乙醇沉淀的藤茶多糖粗品，经Sevag法脱蛋白3次、DEAE-Sephadex A-25柱层析分离和Sephadex G-200柱层析纯化获得藤茶多糖组分AGP-3。
       4.2 AGP-3的纯度鉴定
       与基本性质经Sephadex G-200柱层析和HPLC鉴定，AGP-3为分子量分布相对均一多糖。AGP-3冻干样为白色絮状固体，属非淀粉多糖；中性糖、糖醛酸和蛋白质质量分数分别为57.6%、32.3%和 3.5%。资料显示，以一种单糖作标准测定杂多糖的含量存在误差，而己糖醛酸的存在对苯酚-硫酸法测定中性糖含量存在干扰 ［7］，更准确的测定糖含量的方法需要根据杂多糖的单糖组成和己糖醛酸含量加以校正。
       4.3 AGP-3的结构分析
       HPLC法测得AGP-3重均分子量为1.02×105Da。气相色谱、红外光谱和核磁共振分析对AGP-3结构作出初步定性：主要由半乳糖、甘露糖、葡萄糖及己糖醛酸组成，包括β-(1→4)、β-(1→6)、α-（1→6）几种糖苷键类型，并含有蛋白质，为一种复合多糖。
       
       本研究采用红外、核磁和气相色谱几种物理分析方法，获得了藤茶多糖AGP-3结构的部分信息，还有待通过化学分析并结合其它物理分析方法，以对该多糖进行更准确的结构表征。
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