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       【摘要】 
       目的为探讨预防性关节内注射丹参注射液对关节粘连的影响。方法将24只日本雄性大耳白兔随机分为3组，每组8只，分别为盐水对照组（A组）、玻璃酸钠对照组（B组）、丹参治疗组（C组）。手术切开右后膝关节，搔刮髌上囊前壁，切除大部分髌上囊后壁滑膜和髌下脂肪垫，术毕用长腿管形石膏固定右后肢膝关节于伸直位。每只动物采用的药物品种及剂量分别是：A组注生理盐水0.3 ml、B组注玻璃酸钠0.3 ml、C组注丹参注射液0.3 ml，共4次。4周后空气栓塞处死动物，行关节活动度测量、关节腔行大体观察、髌上囊滑膜组织的组织学观察和总胶原含量检测。结果关节活动度B、C组大于A组（P<0.01），B、C组之间差异无显著性（P>0.05）；关节粘连计分B、C组均于小A组（P<0.01），B、C组之间差异无显著性（P>0.05）；髌上囊前壁滑膜病变组织学计分B、C组均小于A组（P<0.01），B、C组之间差异无显著性（P>0.05）；髌上囊前壁滑膜组织总胶原含量B、C组小于A组（P<0.01），C组小于B组（P<0.01）。结论丹参注射液关节内注射能有效预防关节粘连，且与玻璃酸钠的效果类似。
       【关键词】  膝关节粘连；丹参注射液；兔
       The Prophylactic Effects of Intraarticular Injection of Salvia Miltiorrhiza on Jiont Adhesions in Rabbit Knee Joints
       DUAN Kan, YUAN Changshen, YAO Hongyi, LIU Yuxiang, LIU Zhengzhi
       The First Affiliated Hospital of Guangxi TCM University, Nanning, Guangxi 530023, China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the prophylactic effects of repeated intraarticular injection of Salvia miltiorrhiza on joint adhesion.Methods24 Japanese rabbits were divided randomly into 3 groups. All right hind knees were made like this: the anterior wall of suprapatellar bursae was scraped, the posterior wall of suprapatellar bursae and the infrapatellar fat pad were cut off. Each knee was injected with physiological saline 0.3 ml for group A, sodium hyaluronate injection 0.3 ml for group B, and Salvia miltiorrhiza injection 0.3 ml for group C. All right hind knees were immobilized in the extension position with a long leg plaster cast for 4 weeks, and injected weekly. ResultsAfter 4 weeks, the joint movement range in group B or C was larger than that in group A (P<0.01), and between group B and group C there had no significant difference （P>0.05）. The scoring of joint adhesions in group B or C was smaller than that in group A (P<0.01),  between group B and group C there had no significant difference（P>0.05）. The scoring of histological change of the synovial membrane in group B or C was smaller than that in group A (P<0.01), and there had no significant difference  between group Band group C（P>0.05）. Total collagens content of the synovial membrane in group B or C was less than that in group A (P<0.01), while that of group C was less than of group B(P<0.01). ConclusionSimilar to sodium hyaluronate, salvia miltiorrhiza can effectively prevent joint adhesions.
       Key words：Joint (Intraarticular) adhesions/Prevention;    Salvia  miltiorrhiza Intraarticular  injection;    Rabbits
       
       关节粘连是关节附近创伤、手术后或关节制动后的常见并发症，是造成纤维性关节僵硬的关节内原因。关节粘连一旦形成，治疗极为棘手，甚至造成患者终生残废，故其预防尤显重要［1］。我们在初步研究发现丹参注射液有预防关节粘连作用［2］的基础上，改进造模方法、增加用药频次和调整观测指标，开展了进一步的研究。
       1 动物与分组
        选择成年健康日本雄性大耳白兔24只（广西中医学院实验动物中心提供，许可证号：SYXK桂2003-0001），体重2.0～2.5 kg。随机分成3组：A组（盐水对照组）、B组（玻璃酸钠对照组）、C组（丹参治疗组），每组8只，分别编号。
       2 方法
       2.1 造模与处理 
       用0.9%生理盐水将化学纯氨基甲酸乙酯配成25%的溶液，按1 g·kg-1体重（4 ml·kg-1体重）耳缘静脉注射麻醉。参照叶根茂等［3］的方法，剪除右后肢膝关节周围体毛，碘伏消毒手术野皮肤，无菌下行右侧膝关节髌旁内侧切口长约3 cm，切开关节囊，将髌骨向外翻转，用刀片搔刮髌上囊前壁滑膜，用刀柄推开髌上囊后壁在股骨前面的附着部，切除大部分髌上囊后壁和髌下脂肪垫，止血；缝合关节囊及皮肤，经关节囊外行关节穿刺，先抽净关节内积血，再将药物注入关节腔。每只动物采用的药物品种及剂量分别是：A组生理盐水0.3 ml，B组玻璃酸钠0.3 ml（山东博士伦福瑞达制药有限公司，批号060530022），C组丹参注射液0.3 ml（上海第一生化药业有限公司，批号060804）。术后长腿管型石膏固定右后肢于膝关节伸直位4周，膝关节前侧石膏开窗以便注药。以后每周经皮关节穿刺并注药1次，每组每只共注药4次。对侧肢体（左后肢）不予干预。术后分笼标准饲养，肌注庆大霉素2万U，2次/d，共3 d。于固定4周后予空气栓塞处死，拆除石膏固定后，每只动物依次行关节活动度测量、关节腔大体观察、切取髌上囊前壁滑膜组织（一式两份）行组织学观察和总胶原含量检测。
       2.2 关节活动度测量
       实验结束时，每组8只动物行关节活动度测量。固定动物右大腿近段于台上，于膝关节下10 cm处用500 g拉力牵拉关节屈曲5 min，用长柄关节活动度测量器测量出膝关节屈曲角度，即为关节活动度。
       2.3 关节粘连
       大体观察关节活动度测量后，打开关节腔行大体观察。参照叶根茂等［3］的标准，将关节粘连情况定为5级，计分为0～4分。滑膜光滑，髌上囊及关节腔大小正常，无粘连为0级，计0分；滑膜轻度水肿，髌上囊缩小约1/4，关节腔内少量散在丝状粘连为Ⅰ级，计1分；滑膜中度水肿，髌上囊缩小约1/2，关节腔内较多散在丝状粘连为Ⅱ级，计2分；滑膜明显水肿，髌上囊缩小约3/4，关节腔内较多散在丝状粘连为Ⅲ级，计3分；髌上囊基本消失，关节腔内致密粘连为Ⅳ级，记4分。
       2.4 组织学观察
       大体观察后，立即切取一份髌上囊前壁滑膜组织。取材后的标本经4%多聚甲醛溶液固定24～48 h，递增浓度乙醇脱水，石蜡包埋，间断连续切片，厚3 μm。HE染色、光镜下观察。髌上囊前壁滑膜组织学观察：将滑膜病变定为4级，计分为0～3分。滑膜完整，细胞排列整齐，无充血水肿、无炎细胞浸润为0级，计0分；滑膜充血水肿，表层细胞增生为Ⅰ级，计1分；滑膜细胞呈乳头状增生，滑膜内血管增生，肉芽组织形成为Ⅱ级，计2分；滑膜内肉芽组织纤维化，伴有淋巴细胞和浆细胞浸润为Ⅲ级，计3分。
       2.5 总胶原含量的测定　
       将另一份髌上囊前壁滑膜组织标本每个称取3～5 mg，储存于－20℃冰箱中，严格按南京建成生物研究所提供的羟脯氨酸测试盒（编号：20061116）的实验步骤行羟脯氨酸含量测定，再按胶原中含有13.4%的羟脯氨酸，折算出总胶原含量。
       2.6 统计方法 
       本研究的数据以±s表示。采用SPSS 11.0 for Windows统计软件进行数据录入和统计处理。
       3 结果
       3.1 一般情况
       正式实验期间动物健康状况良好，无腹泻，无死亡。部分动物固定后3 d内出现患侧足部不同程度的肿胀(严重者予远端石膏部分松开)，均于1周后消失。动物啃咬石膏、致石膏缺损严重而失去固定作用者及时修补或更换，以确保每天均达到有效固定。
       3.2 关节活动度测量
       各组关节活动度见表1。统计结果显示，用药各组（B，C组）关节活动度大于盐水对照组（A组）（P<0.01）；B，C组之间差异无显著性（P>0.05）。
       3.3 关节粘连大体观察 
       各组关节粘连计分见表1。统计结果显示，用药各组（B，C组）关节粘连计分均小于盐水对照组（A组）（P<0.01），说明用药各组关节粘连程度均比盐水空白组轻；B，C组之间差异无显著性（P>0.05）。表1  各组关节活动度、关节粘连计分、滑膜病变计分和总胶原含量（略）
       3.4 组织学观察
       各组髌上囊前壁滑膜组织病变计分见表1。统计结果显示，用药各组（B，C组）病变计分均小于盐水对照组（A组）（P<0.01），说明用药各组滑膜病变程度均比盐水对照组轻；B，C组之间差异无显著性（P>0.05）。
       3.5 髌上囊前壁滑膜总胶原含量 
       各组髌上囊前壁滑膜组织总胶原含量见表1。统计结果显示，用药各组（B，C组）的总胶原含量低于与盐水对照组（A组）（P<0.01），表明造模4周后用药组关节内用药能明显地降低实验动物滑膜的总胶原含量，减轻关节粘连；C组与B组比较（P<0.01），表明关节内注射丹参注射液比注射玻璃酸钠更能减少实验动物滑膜的总胶原含量。
       4 讨论
        关节粘连形成可看作为组织的纤维化，其开始于炎性反应，伴随中性粒细胞浸润到受损组织的血凝块内，随后巨噬细胞迁移，继而出现成纤维细胞及胶原沉积，导致关节内组织发生一系列粘连的病理改变，造成不同程度的膝关节屈伸障碍［4］。因此，防止术后再粘连非常重要。
       
       丹参化学结构基本清楚、临床应用时间较长、价格便宜，具有改善微循环、抗炎、抗氧化、抗纤维化、促进损伤组织修复等多种功效［5］，降低其胶原的合成、分泌，促进成纤维细胞凋亡，具有防治多种形式、多类组织器官的粘连或纤维化的作用，如皮肤瘢痕、角膜瘢痕、硬膜外粘连、肺纤维化、肝纤维化等，上述的研究结果是本实验设计的基础。
        胶原含量是决定修复组织机械强度的一个关键性因素，组织羟脯氨酸水平是衡量粘连程度的一个有效指标。Ozogul等［6］实验研究中发现粘连程度分级与组织羟脯氨酸水平是线性正相关，认为组织羟脯氨酸水平是粘连程度的有力指标，它比粘连程度分级更敏感、更客观。本研究同样证实了粘连程度分级与组织羟脯氨酸水平之间的相关关系。虽然丹参治疗组关节活动度、关节粘连计分、滑膜病变计分小于玻璃酸钠对照组，但丹参治疗组总胶原含量小于玻璃酸钠对照组。玻璃酸钠作为一种预防粘连药物，具有良好的生物相容性和可降解性，起到屏障作用，但不能有效抑制滑膜组织胶原含量的产生；而丹参减少滑膜组织的胶原含量，预防关节粘连可能与以下因素有关：①通过提高嘌呤核苷磷酸酶水平，增强网状内皮系统的吞噬能力，有利于加速血肿和炎性介质的清除，加速创伤的清扫过程，使得损伤早期得以恢复，而胶原沉积量减少，粘连减轻；②丹参可有效抑制成纤维细胞的增殖，减少胶原等细胞外基的沉积［7］，发挥预防粘连的作用。本研究显示，丹参能显著减少髌上囊前壁滑膜病变计分，减轻滑膜损伤性修复后期的肉芽组织纤维化及瘢痕形成。亦有人认为关节纤维化与T细胞诱导的免疫反应密切相关［8］，而丹参的抗炎和免疫调节作用［5］可能是其减少滑膜病变计分的原因；③羟脯氨酸是形成胶原的前体，能反映胶原代谢情况，反映组织粘连的程度。丹参通过降低羟脯氨酸掺入量，使胶原合成下降，从而有效地预防关节粘连。另外，丹参还可激活单核/吞噬细胞系统，分泌多种生长因子，使得软组织损伤早期得以恢复而胶原沉积量减少，粘连减轻。
       
       综上所述，丹参能显著增加兔膝关节粘连模型的关节活动度，减少关节腔粘连计分，减少滑膜组织的胶原含量。证实丹参能减轻关节粘连程度，部分预防关节粘连的发生，与玻璃酸钠的效果类似，表明丹参膝关节内注射可以有效预防术后关节粘连，对膝关节功能恢复十分有利。因此，丹参膝关节内注射不失为一种预防术后关节粘连的好方法。
       【参考文献】
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       ［5］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草,第7卷［M］.上海:上海科学技术出版社,1999:6191.
       
       ［6］Ozoul Y, Baykal A, Onat D,et al. An experimental study of the effect of aprotinin on intestinal adhesion formation［J］.Am J Surg, 1998, 175(2):137.
       
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       ［8］Bosch U,Zeichen J,Skutek M,et al.Arthrofibrosis is the result of a T cell mediated immune response［J］.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc,2001,9(5):282.