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       【摘要】 
       目的评估藏药护骨十五丸抗老年雌性大鼠骨质疏松的效果。方法50只雌性22月龄老年大鼠，分为藏药护骨十五丸大、中、小剂量治疗组，雌激素治疗组及老年模型组，连续给药50 d；另6月龄大鼠12只作为青年对照组。观察各组实验大鼠骨形态、骨密度、骨生物力学的改变。结果22月龄雌性大鼠可作为骨质疏松的实验模型；护骨十五丸大剂量治疗组可显著增加骨松质面积、骨皮质指数（30％，15％,P<0.05），可显著增加股骨骨密度、股骨的最大变形能力，减少骨钙丢失。结论藏药护骨十五丸对老龄雌性大鼠骨质疏松有显著改善或阻止骨质疏松发展的作用，提示该制剂对女性绝经后期骨质疏松症具有预防和治疗作用。
       【关键词】  骨质疏松；老年；雌性大鼠；护骨十五丸
       骨质疏松症(osteoporosis, OP)是骨骼骨基质和骨矿物质丧失所致的一种骨代谢性疾病，以骨显微结构改变、单位骨体积骨量减少和骨生物力学改变为特征［1］。世界上骨质疏松患者约达2亿人，骨质疏松症成为危害老年人健康的重大公共卫生问题。目前骨质疏松症的临床治疗多以西药为主，如雌激素、降钙素、钙剂、维生素D、二磷酸类及氟化物等［2］，医学上虽开发了较多抗骨质疏松药物，但仍未成为主导疗法［3］。祖国医学是一个丰富的宝藏,对骨质疏松有丰富的论述，认为肾虚是腰腿痛的根本原因，藏药护骨十五丸系杜仲、续断、乳香、没药、雪莲花、西红花等组成，有补肾壮腰、温经活血之功效。本实验主要观察藏药护骨十五丸治疗老年雌性大鼠骨质疏松的效果，以期找到一种预防和治疗骨质疏松的有效药物。
       1 材料
       1.1 药物
       藏药护骨十五丸系杜仲、续断、乳香、没药、雪莲花、西红花等组成,本研究按动物实验要求,取胶丸制备成供试药物(自制)。
       1.2 动物健康
       纯种SD大鼠62只，雌性，其中22月龄50只，体重（330±14）g，6月龄大鼠12只，由西安交通大学动物中心提供（国家A级实验动物）。全部大鼠饲养条件一致，自由摄食，喂以大鼠标准饲料（由西安交通大学动物中心提供），饮用蒸馏水。
       2 方法
       2.1 老龄大鼠骨质疏松模型的选定
       为能更确切模拟人类原发性骨质疏松症的发生发展过程，本实验采用老龄未曾生育大鼠作为实验动物模型。50只老龄未经生育大鼠自然饲用常规饲料和蒸馏水22个月，作为老龄大鼠骨质疏松实验模型。
       2.2 治疗分组及治疗时间
       采用老龄大鼠实验模型，随机分为5组：大剂量治疗组（A组，剂量：3.5 g/kg，质量分数35%）10只；中剂量治疗组（B组，剂量：1.5 g/kg，质量分数15%）11只；小剂量治疗组（C组，剂量0.5 g/kg，质量分数5%）9只；无措施22月老年模型组〔D组，0.6 g/kg,6.0%(g/g)乳剂〕9只；己烯雌酚组〔E组，0.04 mg/kg,0.4%（mg/g）乳剂〕11只；另6月龄大鼠12只作为青年对照组〔F组，0.6 g/kg，6%（g/g）乳剂〕。其供试液溶剂大、中、小剂量组，老年模型组，己烯雌酚组，青年对照组均用伯洛沙姆制成6.0%(g/g)乳剂，治疗期为50 d。
       2.3 取材
       实验动物在20%乌拉坦溶液麻醉〔（0.5 ml·100 g-1）〕下, 腹腔动脉抽血处死，取动物双侧后肢股骨、胫骨，分别固定于4 % 多聚甲醛中或放置于低温冰箱固定和保存。备测骨钙的股骨以纱布包裹后放置于低温冰箱固定和保存。
       2.4 观察指标与方法
       2.4.1 组织形态学观察
       取股骨上段中1/2段, 经4%多聚甲醛固定，8％的中性EDTA脱钙液脱钙40 d，常规石蜡包埋，用9%的多聚赖氨酸处理载玻片，切片，每张6 μm，伊红—苏木素染色。
       2.4.2  骨形态学测量 股骨的石蜡切片经HE染色后应用北航医学半自动彩色图像分析系统分析测量。以关节软骨下1 mm的松质骨区域，每张切片测量3个视野（放大倍数 40×，测定面积限定为274 753 μm2），取平均值，测量骨小梁相对面积。
       2.4.3 骨皮质厚度指数
       取股骨中部横断面HE染色切片，光学显微镜下测量计算骨皮质厚度指数。计算方法如下：
       
       骨皮质厚度指数＝AB+CD/AD
        其中AB，CD，AD见图1（4～8个部位处测量后求均值） 。
       2.4.4 股骨钙含量测定
       取适量股骨精密称重,置消化罐中,加混合酸(HNO3∶HClO4=4∶1)3 ml,密闭后置烤箱中105℃消化2 h,消化液取不同稀释度分析各元素含量。 钙(Ca)采用Z-8000型塞曼偏振原子吸收分光光度计分析。钙元素分析过程中的质量控制用USEPA和粉质发样进行质控，采取混合血样控制。样品处理过程中尝试了灰化法、试管内混合酸消化法,最终选择了密闭消化罐消化,并做了回收实验,回收率97.4%～104.2%。
       2.4.5 骨矿密度(BMD)测定
       用QDR-2000型HOLOJAC双光子骨密度仪测量股骨骨矿密度, 放射源为镅241Am,误差≤ 3 %。测量时，将各离体骨按一定顺序放入有机玻璃盒内，注入蒸馏水（以刚好盖过所有骨面为宜）进行扫描。使用Regional high resolution QDR 4500 小动物分析软件。
       2.4.6 骨生物力学测定
       右股骨用微机控制电子万能试验机进行三点力学试验，观察最大应力。当外力作用于骨时，骨以形变产生内部的阻抗即骨产生的应力来抗衡外力用最大负荷力表示，单位为g/cm 2。应变是指骨在外力作用下的变形，大小等于骨受力后长度的变化量，用最大负荷表示，单位为厘米。测量时，调整两个约束支架相距20 mm ,将两个大鼠股骨比较均匀的部位放在两个约束支架上，股骨的短轴与垂直方向平行，逐级加压直至破坏，读取导致破坏的负荷的数据。待测试件用生理盐水保持湿润，荷载测量精度为0.1 N，变形测量精度为0.001 mm。
       2.5 统计学处理
       所有数据输入计算机，用SPSS 10.0 for windows软件进行t检验和方差分析，计算结果以±s表示，检验水准α＝0.05，P＜0.05。
       3 结果
       3.1 骨质疏松大鼠模型骨形态学变化
       股骨远端松质骨切片显示，青年对照组骨小梁密度高而完整，排列规则；老年模型组骨小梁明显稀疏，排列不整，骨小梁间隙增大，骨小梁面积比增大，老年模型组骨小梁密度、骨小梁面积显著低于青年对照组(见表1)，证实骨质疏松大鼠模型成立。表1  实验大鼠各组骨形态学测量结果比较（略）
       3.2 藏药护骨十五丸对骨形态学的影响
       表1示护骨十五丸大、中剂量治疗组骨小梁密度显著高于老年模型组（P<0.05），达到雌激素治疗对照组水平（P>0.05），但上述各组均显著低于青年对照组水平（P<0.05）。大剂量治疗组骨皮质指数比显著高于老年模型组（P<0.05），且达到青年对照组水平（P>0.05）。护骨十五大剂量组增加骨小梁面积较增加骨皮质指数比明显（30％∶15％,P<0.05）。
       3.3 各实验组骨钙含量比较各实验组骨钙含量
       结果表明（见表2），护骨十五丸大、中、小剂量治疗组大鼠股骨钙含量与雌激素治疗对照组之间无显著性差异，但显著高于老年模型组，低于青年对照组（P<0.05）。表2  实验各组大鼠骨钙含量和骨密度比较（略）
       3.4 股骨及椎体骨密度股骨骨密度测试
       结果表明（见表2），护骨十五丸大剂量组显著高于老年模型组，但仍显著低于青年对照组（P＜0.05）；同时中、小剂量组与雌激素组、老年模型组之间无显著性差异（P＞0.05）。椎骨骨密度测试结果表明，大、中、小剂量组与雌激素组、老年模型组之间无显著性差异（P＞0.05），均显著低于青年对照组（P<0.05）。
       3.5 股骨生物力学骨生物力学测试
       结果表明（见表3），护骨十五丸大、中、小剂量治疗组与雌激素组骨最大负荷力无显著性差异，均低于青年对照组（P＜0.05）。护骨十五丸大、中、小剂量治疗组与雌激素组之间骨最大变形无显著性差异，但高于老年模型组，低于青年对照组（P<0.05）。表3  实验各组大鼠骨生物力学结果比较（略）
       4 讨论
          
       本实验结果显示藏药护骨十五丸可提高或改善骨质疏松症的骨显微结构、骨密度及股骨的最大变形，减少骨钙丢失。
        既往研究药物治疗绝经后骨质疏松症的效果，均采用切除卵巢形成的去势雌性大鼠作为模型［4］，但此种模型虽可较好的模仿人类妇女正常绝经的骨丢失状态，但去势雌性大鼠股骨纵径及股骨中轴的骨生物力学及骨密度不发生显著性改变［5］，因此不符合人类自然衰老的状态。伴随着绝经时间的增加，老年妇女的骨质疏松既受绝经因素的影响又受年龄因素的影响［6］。采用未经生育的老年雌性大鼠作为骨质疏松实验模型，可更好的模拟人类老年妇女的骨质疏松症的状态，为研究药物防治绝经晚期妇女骨质疏松症提供较好的基础。
       
       在实验中,为了客观地评价药物的效应,设立了3个对照组,分别为老年模型组、青年对照组、雌激素组(阳性药物组)，藏药护骨十五丸分为3个剂量组,来评价药物的剂量效应。实验结果显示,青年对照组和老年对照组有明显差异,证实了模型的成功选择。
       
       药效学实验结果显示,藏药护骨十五丸可以治疗和预防老年女性绝经后期骨质疏松症，这与藏药护骨十五丸的补肾壮腰、温经活血之功效是相符的。绝经后骨质疏松症属于中医骨痿、骨痹的范畴，医学认为骨质疏松症之病机主要表现为脾肾亏、损气滞血瘀和风寒湿阻,其中脾肾亏盘损是内因,气滞血瘀与风寒湿阻则为外因所致［7］。绝经后妇女不仅肾衰髓减,而且脾气亦衰，脾肾虚则气血运行迟缓,脉络不畅可致血瘀若遇外伤或感受风寒湿邪,即易出现腰腿酸痛等一系列症状［8,9］。立方之关键在于标本兼顾、攻补兼施,既要考虑脾肾不足而补之,又要顾及风寒湿邪与外伤后导致气滞血淤而攻之。杜仲、续断补肾壮腰；乳香、没药活血散瘀、行气舒筋；雪莲花、西红花祛风寒湿邪，全方共奏补肾壮腰、温经活血之功效。
       
       抗骨质疏松的治疗多通过提高骨密度，但抗骨质疏松的最终目标是提高骨生物力学、减少骨折发生率，尤其是股骨颈、椎体的骨折率［10］ 。用大、中、小3组剂量的藏药护骨十五丸治疗自然衰老的雌性骨质疏松症大鼠的结果表明，大剂量组可明显改善股骨骨质疏松的显微结构、骨密度及股骨的最大变形，减少骨钙丢失，表明藏药护骨十五丸可以通过改善骨的皮质厚度、骨松质的显微结构及增加骨密度多途径而提高骨的生物力学性能，因此可以治疗和预防老年女性绝经后期骨质疏松。
        本实验中虽然低、中剂量藏药护骨十五丸对骨质疏松的效果没有达到统计学上的显著性差异，但仍能看出其对骨质疏松具有剂量-效果效应的趋势，随着给药剂量的增加，改善骨质疏松的效果越明显，但其最佳有效剂量尚待进一步研究。
       
       本实验结果表明，藏药护骨十五丸可以通过改善骨的皮质厚度、骨松质的显微结构及增加骨密度多途径而提高骨的生物力学性能，提示藏药护骨十五丸可治疗和预防老年女性绝经后期骨质疏松。
       【参考文献】
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