【摘要】 目的在扫描电镜下对采集于河南、河北、湖北和贵州四省共14个居群栝楼花粉形态进行观察，为栝楼种质资源多样性研究提供参考。方法利用扫描电镜，对不同居群栝楼花粉粒大小、形态及表面纹饰和萌发沟形态等方面进行观测，并对结果进行聚类分析。结果14个居群栝楼花粉均为扁球形或近球形，花粉表面纹饰均呈穴状。不同居群在极轴长、赤道轴长、赤极比、孔穴密集程度以及萌发沟形态上有所差异。结论花粉形状和表面纹饰是不同居群作为同种植物所具备的共同特征；花粉大小及萌发沟形态的差异则体现出不同居群的差异，可以作为栝楼种质资源多样性的佐证。
【关键词】 栝楼；花粉；赤轴；极轴
Observation on the Pollen Morphology of Different Geographical Populations of Trichosanthes kirilowii Maxim.
XIE Guozhen, SHU Shaohua, WANG Mo
Medicinal Plant Institute of Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei, 430070 China
Abstract：ObjectiveTo study the biodiversity of Trichosanthes kirilowii Maxim.. MethodsThe pollen morphology of 14 different geographical populations were observed under scanning electronic microscope (SEM). ResultsWe found that different populations were similar in shape and surface omamentation, but different in body size and germinator. ConclusionThe results indicated that the morphology of shape and surface omamentation is the common character of T. kirilowii, and the difference in size and germinator between geographical populations shows the species biodiversity.
Key words：Trichosanthes kirilowii Maxim.; Pollen morphology; Polar axis; Equatorial axis
栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.，葫芦科栝楼属Trichosanthes L.植物，雌雄异株，多年生草质藤本，是一种药用价值很高的植物。其果实（瓜蒌）、根（天花粉）和种子（瓜蒌子）都是常用中药材。栝楼在全国各地都有种植，多生于山坡、山谷、灌丛和林缘等地方，种质资源非常丰富［1］。
孢粉学作为一门新兴学科，在植物研究中的作用主要体现在探讨植物起源、演化、分类、亲缘关系等方面［2］。不少研究结果证明可依据花粉形态的差异对植物进行分类［3～5］，也有研究者根据花粉形态探求其植物遗传变异的可能轨迹［6，7］。已有的研究多将栝楼列入葫芦科［8］、栝楼属［9］或瓜类［10］的大范围中进行比较研究，而单独分析栝楼种质资源的研究较少。本文主要通过扫描电镜，观察了不同居群栝楼花粉的大小、形态、表面纹饰及萌发沟等方面特征，明确了栝楼花粉形态特征；通过聚类分析，进一步分析了不同居群栝楼间的亲缘关系，为其种质资源多样性研究提供孢粉学参考。
1 材料与仪器 1.1 材料
材料于2006年采自河南、河北、湖北和贵州四省的不同地方，共14个居群，均为野生种，经湖北中医学院刘合刚教授鉴定为正品栝楼，现种植于华中农业大学药用植物资源圃。居群编号与采集地见表1。
1.2 仪器
JSM-6390 LV扫描电镜、JEOL JFC-1600离子溅射仪。
2 方法 2.1 样品采集及观察
分别采集不同居群当天开放花的花粉，把花粉均匀弹撒在双面导电胶上，将粘有花粉的载物铜台放入JEOL JFC-1600离子溅射仪中喷镀铂金，置于JSM-6390 LV扫描电镜下观察、记载，并选有代表性的视野分200×(群体)、1 700×(个体)、15 000×(局部)3种类型照相记录。每居群选择20个有代表性的花粉粒，测量其极轴长和赤轴长，计算均值和极赤比，并观察花粉表面纹饰及萌发沟形态。
聚类分析中，极轴长、赤道轴长、极赤比、萌发沟数目等量化指标用均值，表面纹饰、萌发沟形态等定性指标使用赋值。赋值标准：花粉表面孔穴数目小于150 个/mm2为稀疏，赋值为0；大于150个/mm2为密集，赋值为1。萌发沟较短者赋值为0；较长者赋值为1。萌发沟较浅者赋值为0；较深者赋值为1。孔膜未凸起者赋值为0；凸起者赋值为1。表1 居群编号与采集地（略）
2.2 数据分析
所得数据用SAS 8.1软件进行方差分析和聚类分析。
3 结果与分析 3.1 不同居群栝楼花粉形态特征在扫描电镜下，14个居群栝楼花粉均为单粒花粉，呈扁球形或近球形，极面观3裂圆形或4裂圆形。表面纹饰均为穴状，孔穴为近圆形或不规则形，孔穴密集程度在不同居群间有不同。萌发沟数目为3或4，对称性较强，边缘处孔穴较稀疏。萌发孔位于赤道面，不同居群在萌发沟深浅、长短，孔膜是否凸起有差异。各居群栝楼花粉形态见图1。
3.2 不同居群栝楼花粉形状测量14个居群栝楼花粉粒极轴长、赤道轴长，计算均值和极赤比；观察花粉表面孔穴密集度及萌发沟形态。结果见表2。
从表2可以看出，14个居群栝楼花粉极轴长度为35.81～41.44 μm，XY-1，HC极轴长度与其它居群有极显著差异。赤道轴长度为40.89～46.82 μm，XY-1，YC，HD，GZ，NX-1，DZ-2与其它居群的差异达到极显著水平。赤极比为0.85～0.91，HC和NX-1、XH和DZ-1与其它居群差异极显著。XY-1花粉最大，平均大小为41.44 μm×46.82 μm；GZ和DZ-2花粉较小，均值分别为35.81 μm×41.12 μm和36.25 μm×40.89 μm。XH，GZ，NX-2，DZ-1，DZ-3，DZ-4，DZ-5等居群花粉属于扁球形（0.816
花粉表面孔穴较密集的居群有XH，XY-1，HD，GZ以及DZ-2。XY-1，XY-2，YC，HC，GZ等5个居群萌发沟数目为4，其余居群则为3。XY-1，NX-2，DZ-1，DZ-3和DZ-4萌发沟较长、深；XH，XY-2，HD，HC，NX-1等居群萌发沟较短、浅。除HC，GZ，DZ-1外的居群孔膜皆为凸起。
3.3 不同居群栝楼花粉形态的聚类分析用最短距离法对极轴长、赤道轴长、极赤比、孔穴密集度、萌发沟数目、萌发沟深浅、萌发沟长短以及孔膜是否凸起等8个指标进行聚类分析，结果见图2。
NX-2和DZ-3在距离0.22处首先被聚为一类，说明两者是亲缘关系较近的居群。同样的，GZ和DZ-2，DZ-1和DZ-5也是距离较近的居群，体现了他们较近的亲缘关系。从图1可以看出，在距离0.65处，所有居群可以被分为2类，其中，第一类包括XH，XY-1，HC，DZ-1，DZ-5等居群；第二类包括XY-2，YC，HD，GZ，NX-1，NX-2，DZ-2，DZ-3，DZ-4等居群，两大类居群间的亲缘关系较远。而第二类又可以被分为2类，分别是XY-2，YC，NX-1，NX-2，DZ-3，DZ-4以及HD，GZ，DZ-2。
4 讨论
4.1 不同居群栝楼花粉形态比较
植物花粉的形态结构具有很强的遗传保守性，萌发沟(孔)的数目、位置及特征是分类的主要依据［2、13］。本研究观察比较了14个居群栝楼花粉形态，结果表明，栝楼花粉为扁球形、近球形；极面观为3裂椭圆形或4裂椭圆形；3～4萌发沟；表面为穴状；极轴（P）长度为35.81～41.44 μm，赤道轴(E)长度为40.89～46.82 μm，P/E=0.85～0.91，与前人研究结果一致［8～10］。
花粉形状、萌发沟位置及表面纹饰的一致性说明了14个居群栝楼具备作为同种植物的共同特征。而花粉大小、孔穴密集度、萌发沟数目及形态、孔膜形态的差异则反映了栝楼在遗传过程中发生的变异多样性。因此，花粉形状、萌发沟位置及表面纹饰可以作为同种植物鉴别的依据；而花粉大小、孔穴密集度、萌发沟数目及形态、孔膜是否凸起可以探究不同居群栝楼间的亲缘关系，为栝楼种质资源多样性研究提供参考。
4.2 不同居群栝楼花粉形态的聚类分析
花粉比其他组织器官有着更稳定的性状，外界因素变化对其形态结构的影响较小［2］。有研究表明，同一种属中，花粉形态相近的品种其亲缘关系也较近［4，11，12］。聚类分析的基本思想是根据事物间的接近程度将样品逐一归并成类，从而形成谱系图。因此本研究利用聚类分析方法对不同居群栝楼花粉形态进行分类，探究其间的亲缘关系。
本研究的14个居群栝楼被分两大类，对分类结果进行分析，发现花粉粒大小（P×E）为分类的主要指标，孔穴密集度为次要指标。XH，XY-1，HC，DZ-1，DZ-5等居群因为花粉粒较大而被归为一类；而在花粉粒较小的第二类中，又根据孔穴密集度将XY-2，YC，HD，GZ，NX-1，NX-2，DZ-2，DZ-3，DZ-4等居群细分为两类，孔穴较密集的HD，GZ，DZ-2另成一类。从聚类图可以看出，GZ和DZ-2，DZ-1和DZ-5，NX-2和DZ-3为距离较近的居群，因此，我们可以推测他们之间的亲缘关系是较近的，另外，分处于两大类中的居群亲缘关系较近，两大类之间居群的亲缘关系较远。
虽然花粉形态因其相对稳定性可揭示物种的遗传本质，但单凭孢粉学上的证据下结论是不全面的，只有与细胞学、同工酶、分子标记等方面结合起来研究，才可得到较客观的结论。
4.3 从花粉形态讨论
栝楼植物的进化花粉形状与大小与花粉的调节功能有关。花粉越长，其调节功能越强，说明其种群越进化［11］。栝楼花粉属于椭圆形或近圆形，说明其调节功能较弱，反映出栝楼属于进化中较原始的种群。
有研究表明，花粉表面纹饰一般是从原始种群的简单光滑到进化种群的复杂粗糙演化。演化趋势大致为从光滑到小穴、小沟，到颗粒状突起，再到棒状、刺状、鼓棰状，最后演化成网状、皱波状、条纹状［7，13］。栝楼花粉表面为圆穴或不规则穴状，从演化途径上看应该属于进化中较原始的种群。
学者把萌发器官的演化分为4个阶段，分别是无固定萌发孔阶段、近极萌发孔阶段、远极萌发孔阶段以及赤道萌发孔阶段。而赤道萌发孔阶段又可能从原始的单远极沟进化，继而出现三沟类、三孔沟类、三孔类等一系列赤道萌发孔的被子植物花粉类型［13］。从萌发器官的形态来看，栝楼花粉有3或4条萌发沟，说明其具有被子植物花粉萌发器官的一般特征。综上所述，可以推断，栝楼是被子植物中较原始的种群。
【参考文献】
［1］宋振巧,王洪刚,王建华.栝楼的研究进展［J］.山东农业科学,2005,43（5）:72.
［2］潘建国.试论应用孢粉学及其新进展［J］.微体古生物学报,2002,19（2）：206.
［3］张丽娜,雷家军,韩凌，等.百合属(Lilium)几种植物花粉形态的观察［J］.西北农业学报,2006,15(6):174.
［4］张西丽,周厚高,周焱,等.几个百合品种花粉电镜观察及其亲缘关系分析［J］.广西农业生物科学,2000,19（3）:175.
［5］蔡秀珍,刘克明,丛义艳,等.凤仙花属(Impatiens L.)10种植物花粉形态的扫描电镜观察［J］.植物研究,2007,27（3）:279.
［6］邓小燕,周颂东,何兴金.中国黄精属13种植物花粉形态及系统学研究［J］.武汉植物学研究，2007,25(1):11.
［7］袁涛,王莲英.几个牡丹野生种的花粉形态及其演化、分类的探讨［J］.北京林业大学学报，1999,21（1）:17.
［8］杨德奎,马成涛,宋艳梅.葫芦科8属11种植物花粉形态的扫描电镜观察［J］.广西植物,2008,28（2）:148.
［9］黄璐琦,乐崇熙,杨 滨,等.栝楼属的系统学研究［J］.江西中医学院学报,1999,11（2）:75.
［10］庞丽琴,付宝春,康红梅,等.瓜类植物花粉形态扫描电镜观察［J］.山西农业科学，2006,34(4):39.
［11］吴祝华,施季森,席梦利,等.百合种质资源花粉形态及亲缘关系研究［J］.浙江林学院学报，2007,24(4):406.
［12］曲波,翟强,许玉凤,等.4种忍冬属植物花粉的形态比较［J］.沈阳农业大学学报,2006,37（1）：96.
［13］方从兵.我国果树孢粉学研究进展［J］.安徽农业大学学报,2002,29（2）：154.