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       【关键词】  蟾皮二烯内酯；,,大孔树脂；,,工艺
       摘要：目的建立大孔树脂富集蟾皮总二烯内酯的工艺。方法蟾皮醇提液减压回收醇，经石油醚脱脂，水层上DM130大孔树脂，不同浓度乙醇梯度洗脱，TLC显色结合HPLC法检测二烯内酯所在洗脱部位，比色法测定总二烯内酯含量。结果蟾皮中二烯内酯集中在70%乙醇洗脱部分；采用本实验确定的工艺，制得蟾皮总二烯内酯含量为53.90%，收率为0.23%。结论 该工艺可以较好地富集蟾皮总二烯内酯。
       关键词：蟾皮二烯内酯；  大孔树脂；  工艺
       Study on Enriching Total Bufadienolides from the Skin of Toad by Macoroporous Resin
       ZHAO Dazhou， QIU Yingkun， CHEN Jiyong， LIU Shumei， JIANG Yongtao
       (Research Institute for Drugs, Luye Pharmaceutical Co. Ltd, Yantai 264003, China; School of Pharmacy, Yantai University, Yantai 264005, China)
       Abstract：ObjectiveTo establish processing method for enriching total bufadienolides from the skin of toad by macoroporous resin. MethodsThe alcohol extraction of the skin of toad was separated by water-petroleum ether phases after eliminating alcohol. Then the water part was added to the column of DM130 macoroporous resin, and eluted gradually by alcohol. The total bufadienolides was identified to be in which part by HPLC and TLC, and the content was determined by UV, telocinobufagin as reference substance, at 299nm.ResultsThe total bufadienolides was gathered in 70% alcohol. The content of total bufadienolides was 53.90%, the extracting rate was 0.23%. ConclusionThe processing technology can be used to enrich total bufadienolides from the skin of toad.
       Key words：Bufadienolides;  Macoroporous resin;  Process
   
　　蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor 或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥表皮，临床用于治疗多种癌症、小儿疳积、局限性硬皮病及小儿腮腺炎等。现代药理研究表明，二烯内酯为其主要活性成分，具有抗肿瘤、抗病原微生物及强心等作用［1~4］，其分离工艺未见报道。本实验旨在找到一种利用大孔树脂分离蟾皮总二烯内酯的工艺条件。
       　1  仪器与材料
       Waters 2487型高效液相色谱仪，Waters515泵，Discovery C18柱（25 cm x 4.6 mm；5 micron）； UV-2550型紫外分光光度计，1 cm石英吸收池；甲醇为分析纯，乙腈为色谱纯；远华蟾毒精对照品（烟台大学药学院天然药化室提供，含量98.53%）；蟾皮药材购自亳州药材市场，产地为山东；大孔树脂DM130购于山东鲁抗医药股份有限公司。
       　　2  方法
       2.1  分析方法制得远华蟾毒精对照品和蟾皮总二烯内酯的甲醇溶液，在200~400 nm之间紫外扫描，测得最大吸收峰分别为299.40 nm和294.60 nm，确定HPLC法及比色法检测波长为299 nm。光谱图见图1。
       2.1.1  远华蟾毒精测定方法（HPLC）Waters2487型高效液相色谱仪；Waters515泵；Discovery  C18柱（25 cm×4.6 mm；5 μm）；检测波长：299 nm；流动相为乙腈水（40∶60）。
       2.1.2  蟾皮总二烯内酯含量测定方法（比色法）按分光光度法，在299 nm测定远华蟾毒精对照品不同浓度溶液的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：y=0.0131x，相关系数：r=1。结果表明，远华蟾毒精对照品在4~100 μg/ml线性关系良好。样品溶液在299 nm测定吸光度，按比色法计算出蟾皮总二烯内酯的含量。
       2.2  大孔树脂上样液的制备称取蟾皮药材150 g，剪碎，加入95%乙醇回流提取两次，1 500 ml/次，合并两次提取液，减压回收乙醇后，加入石油醚萃取两次，水层约150 ml，即得。
       图1  远华蟾毒精及蟾皮总二烯内酯紫外吸收光谱图（略）
       2.3  总二烯内酯洗脱剂的选择分别以水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇各1 000 ml洗脱大孔树脂柱（Φ40 mm,V=400 ml），每1 000 ml接收1份，以HPLC法定性检测远华蟾毒精。 TLC定性检测各馏分中的二烯内酯［5］：①硅胶G薄层板，丙酮氯仿环己烷（3∶3∶4）为展开剂，10％硫酸显色；②硅胶G薄层板，氯仿甲醇（9∶1）为展开剂，20％三氯化锑氯仿溶液显色。
       2.4  总二烯内酯样品的制备及检验称取蟾皮药材1.6 kg，制得上样液，上大孔树脂柱（Φ=8.5 cm,V=2 200 ml），先用50%乙醇洗脱除去杂质，再用70%乙醇洗脱，70%洗脱液减压干燥，得蟾皮总二烯内酯，测定含量，计算收率。
       　　3  结果与讨论
       HPLC法检测各洗脱液，仅70%乙醇洗脱液中检出远华蟾毒精，与对照品对照，保留时间为10.30 min；同时对比各洗脱液液相图谱，可以看出，水、30%乙醇和50%乙醇洗脱液成分各峰保留时间均小于5 min，而石油醚萃取成分及95%洗脱成分，在此条件下均无明显吸收峰，只有70%乙醇洗脱液在5~15 min之间，出现一系列的吸收峰，且TLC显色仅70％乙醇洗脱液呈现阳性，推测液相色谱中，5 min以前出的峰主要为糖、氨基酸和色胺生物碱等极性较大的成分，蟾皮二烯内酯成分集中在70%洗脱液中，由此确定大孔树脂的洗脱工艺为：50%乙醇洗脱除去杂质，再用70%乙醇洗脱。按本法制得样品总二烯内酯含量为53.90%，计算得收率为0.23%。石油醚萃取液及各洗脱液的液相色谱图见图2。
       图2  石油醚萃取液及不同浓度乙醇洗脱液HPLC图（略）
       　　4  结论
       本实验确定的工艺可以有效地富集蟾皮总二烯内酯。
       　　参考文献：
       ［1］  贾彩云，呼文亮，俞小瑞，等.蟾蜍灵对白血病U937细胞生长抑制和凋亡诱导作用［J］.中草药，2005，36(2):244.
       ［2］  Enomoto A, Rho MC, Komiyama k,et al.Inhibitory effects of bufadienolides on interleukin-6 in MH-60 cells［J］. J Nat Prod, 2004,67(12):2070.
       ［3］  Cunha Filho GA, Schwartz CA,Resck IS,et al.Antimicrobial activity of the bufadienolides marinobufagin and telocinobufagin isolated as major components from skin secretion of the toad Bufo rubescens［J］.Toxicon,2005,45(6):777.
       ［4］  Usanova IV, Khushbaktova ZA, Syrow VN,et al.Cardiotropic activity of total bufadienolides from the poison of Central Asian toad Bufo viridis ［J］.Eksp Klin Farmakol,2002,65(4):23.
       ［5］  周学敏，程培元，许美娟，等.蟾酥成分的分析方法［J］.中草药，1992，23(9):490.
       (山东绿叶制药有限公司药物研究院，山东 烟台  264003；烟台大学药学院，山东 烟台  264005)