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       【摘要】 
       目的用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术分析远志Polygala tenuifolia Willd.及卵叶远志P.sibirica L.的遗传多样性。方法反应总体积25 μl，内含10×PCR buffer 2.5 μl,dNTPs 2.0 μl,MgCl2 2.0 μl,引物1.0 μl,模板2 ng,Taq酶0.3 μl。扩增程序为：94℃预变性4 min，然后进行45循环：94℃变性15 s，36℃复性1 min，72℃延伸1.3 min，循环结束后72℃延伸4 min。结果10个引物共检测到154个位点，平均每个引物扩增9.24条带，其中148条带表现为多态性，占总带数的94.3％；距离系数为24时，11个样品明显聚为远志居群和卵叶远志居群两类。结论远志与卵叶远志具有丰富的遗传多样性，遗传聚类与其地理分布有一定的相关性。
       【关键词】  远志；卵叶远志；遗传多样性；随机扩增多态性DNA
       Genetic Diversity of Polygala tenuifolia Willd and P. sibirica L. with RAPD-PCR
       WANG Guangzhi, WAN Deguang
       Pharmacological  School of Chengdu University of TCM,Chengdu  611137,  China
       Abstract:ObjectiveTo analyze genetic diversity of Polygala tenuifolia Willd and P. sibirica L. with RAPD-PCR.MethodsThe RAPD-PCR reaction system was constructed with 2.5 μl 10×PCR buffer, 2.0 μl dNTPs, 2.0 μl MgCl2, 1.0 μl primer, 2 ng template and 0.3 μl Taq with total reaction volume of 25 μl. PCR amplifying sequences were as follows:  Initial denaturating for 4 min at 94℃,then denaturating for 15 s at 94℃, annealing for 1 min at 36℃ and extension for 1.3 min at 72℃. After 45 times cycle, keeping extension for 4 min. Results154 polymorphism strands were detected with 10 primers, among which 148 strands were of polymorphism. Cluster analysis indicated that all samples could be clustered into two populations with distance coefficient of 24. ConclusionPolygala tenuifolia Willd and P. sibirica L. have rich genetic diversity. The genetic clustering has some relevance with geographical distribution of P. tenuifolia Willd and P. sibirica L.
       Key words:Polygala tenuifolia Willd.;  Polygala sibirica L. ;   Genetic diversity; RAPD PCR
        远志来源于远志科（Polygalaceae）植物远志Polygala tenuifolia willd或卵叶远志P.sibirica L.的干燥根，临床应用广泛。近年来由于过度采挖，导致野生药材资源骤减，二者已被收入《国家重点保护野生药材物种名录》，保护级别为Ⅲ级。现在在山西、陕西等地已有大面积栽培，但缺乏栽培的规范化研究以及栽培与野生药材种质资源遗传多样性的研究，这不利于远志药材优良品种的选育和种质资源的评价。目前在国内还未见到远志遗传多样性研究的报道。
       
       随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA RAPD)在药用植物遗传多样性研究方面，已成功用于多种药用植物的DNA指纹图谱构建、真伪鉴定、亲缘关系、种质遗传多样性和药材道地性研究上［1］。本文通过对远志P. tenuifolia Willd.及卵叶远志P.sibirica L. 种质资源RAPD研究分析，探讨远志的遗传多样性，为远志DNA指纹图谱的构建、种质资源遗传多样性研究以及育种奠定基础。
       1  仪器与材料
       1.1 仪器
       HB-100型恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）；Sartorius超纯水系统，DYY-Ⅲ2型恒压电流电泳仪；DYY-Ⅲ型电泳槽（北京六一仪器厂）；Heraeus台式离心机（德国）；SANYO超低温冰箱，VIPseries -86℃（日本三洋）；BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶自动成像系统；Bio-Rad PCR仪，MyCyclerTM ThermalCycler（德国）；Therme ElectronTM 加样器。
       1.2 试剂
       10mer随机引物（北京赛百盛基因技术有限公司），λ-EcoT14I digest DNA Marker (TakaRa)，DNA Marker 15 000(TakaRa)，DNA Marker 2 000(TakaRa)，Taq酶(TaKaRa)2 500   U，dNTPs(TaKaRa) 2.5 mmol/L，MaCl2(TaKaRa)25 mmol/L，10×Buffer（Mg2＋ free）(TaKaRa)，CTAB(Amresco) ，PVP(Sigma)，β-巯基乙醇(Sigma)，琼脂糖（上海 YITO 生物仪器有限公司分发），其余为国产试剂。
       1.3 材料
       分别从四川、甘肃、陕西、山西、河北等地采得远志P. tenuifolia Willd 及卵叶远志P.sibirica L.，采集后立即将新鲜叶片埋入变色硅胶干燥。在实验室保存在-70℃超低温冰箱内。材料收集地点及时间见表1。凭证标本保存于成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室。表1  远志及卵叶远志材料来源（略）
       2 方法
       2.1 基因组DNA的提取
       用CTAB法提取远志基因组DNA：①取约150 mg用硅胶干燥的远志叶片，置-70℃冰箱冷冻1 h，取出后在研钵中快速磨成粉末，迅速将粉末转入1.5 ml离心管中，加入700 μl CTAB提取液，置65℃金属浴中30 min，其间不时摇动。②取出冷却至室温，加等体积氯仿/异戊醇（24∶1），混匀后于12 000 g/min离心10 min。③取上清液，重复操作②。④取上清，加入2/3体积的异丙醇，于-20℃放置30 min，于10 000 g/min 离心10 min，去上清。⑤用80％乙醇洗沉淀2次，风干沉淀。⑥将沉淀溶于100 μl ddH2O中，-20℃保存备用。
         
       采用凝胶自动成像系统照相，检测DNA的质量和含量，取2 μl加样缓冲液（6×Buffer）与10 μl DNA样品混合，在0.9％琼脂糖凝胶上以5 V/cm电压条件下电泳，在紫外灯下观察电泳凝胶。用凝胶自动成像系统照相，用TotalLab软件分析凝胶图像，定量。基因组DNA电泳图谱见图1。
       2.2 RAPD扩增条件的建立
       分别对模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶用量等RAPD扩增条件进行优化。最终确定反应体系为：反应总体积25 μl，内含10×PCR buffer2.5 μl，dNTPs 2.0 μl，MgCl2 2.0μl，引物1.0 μl，模板2 ng，Taq酶0.3 μl。扩增程序为：94℃预变性4 min，然后进行45循环：94℃变性15 s，36℃复性1 min，72℃延伸1.3 min，循环结束后72℃延伸4 min，-4℃保存。扩增产物在1.4%琼脂糖凝胶上电泳，电压5 V/cm，电泳缓冲液为1×TAE。反应产物以DNA Marker 2000为分子量标记，在凝胶成像系统上观察、照像、记录。
       2.3 引物筛选
       利用建立的RAPD条件，对40条10 bp RAPD随机引物进行筛选，选扩增条带清晰、多态性强的10条引物作为RAPD引物。筛选引物的碱基序列见表2。
       2.4 数据处理
       每个样品电泳条带按有或无记录，电泳条带存在时赋值为1。否则赋值为0。利用SPSS10.0 按Nai＆Li(1979)的方法计算材料间遗传相似系数(GS)。计算公式为：GS=2Nxy /(Nx + Ny)，其中Nxy为材料x和y共有的扩增片段数目，Nx 、Ny为材料x、y中出现的扩增片段总数目。根据遗传距离，按UPGMA 法，选择类间平均连锁法（Between group linkage）聚类，距离测量方法用Pearson correlation 法进行测量。
       3 结果
       3.1 多态性分析
       10个引物共检测到154个位点。表2列出了10个引物对11个样品扩增的谱带数、多态带及多态带百分比。其中扩增带数最多的引物是S499，共9条；最少的是S201、S208，共3条；平均每个引物扩增9.24条带，其中148条带表现为多态性，占总带数的94.3％，表现出丰富的RAPD多态性。多态性结果见表2。引物S339的扩增结果见图2。表2  远志及卵叶远志RAPD引物及多态性（略）
       3.2 遗传关系聚类分析
       结果显示，当距离系数为24时，11个样品明显聚为两类，一类为远志居群，另一类为卵叶远志居群，说明远志RAPD分子标记的结果差异与经典形态学分类结论是一致的，均能区分远志及卵叶远志。在卵叶远志居群里，甘肃榆中和甘肃兴隆山卵叶远志遗传距离最小，为8.0，表明二者亲缘关系最近，二者又和四川米易产者聚为一类，距四川茂县产者最远，说明卵叶远志RAPD标记上的差别与其地理分布的不同较一致；在远志居群里，陕西合阳和陕西淳化遗传距离最小，为11.0，表明二者亲缘关系最近，二者又和甘肃镇原聚为一类，河北邢台产者与山西汾阳聚为一类，与四川茂县产者距离最远。结果分析表明，在不同的地理层次上，远志和卵叶远志遗传关系和地理分布存在着一致性，并具有丰富的遗传多样性特征。远志及卵叶远志的遗传聚类图见图3。
       4 讨论
        在提取植物DNA时，习惯用液氮冷冻研磨。本研究将远志干燥的叶片置-70℃冰箱冷冻1 h后取出研磨，再用相应的方法提取，结果与液氮冷冻的方法无差别。提示将实验材料直接超低温冷冻后提取DNA不失为一种简便易行的方法。在用叶片提取DNA的同时，我们也从远志新鲜根的皮层和韧皮部成功地提取了DNA，说明该药材的DNA较易提取。本法提取的DNA未加RNA Rase酶纯化，即可满足RAPD-PCR研究。由于远志含大量的多糖类和酚类成分，如欲进行深入研究，则对提取后的DNA纯化显得尤为必要。
        在远志P. tenuifolia Willd.居群里，四川茂县产者距其他产地的遗传距离最远。我们在进行远志酸含量测定时发现，茂县产者远志酸含量较甘肃、河北以及部分陕西产者高。二者是否有必然的联系，值得深入探讨。
       
       在远志野生资源日益减少的情况下，对远志药材遗传特性与遗传多样性评价显得十分必要，从而为远志人工种植中优良品种的选育提供科学依据。由于采样地点和样本数量有限，本研究所得结果是初步的。今后将扩大样本和采样地的数目，多方法、多手段研究远志的遗传多样性，为该药材品质系统评价、优良品种的选育以及合理的人工栽培提供帮助。
       【参考文献】
         　　［1］邹喻苹，葛颂，王晓东，等.系统与进化植物学中的分子标记［M］.北京：科学出版社，2001：18.