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       【关键词】  黄芩苷；,,大孔吸附树脂；,,纯化
       摘要：目的利用AB8大孔吸附树脂纯化黄芩中黄芩苷,确定树脂纯化黄芩苷的工艺参数。方法以黄芩苷吸附量为指标,并通过正交实验考察确定了该树脂分离纯化黄芩苷的工艺条件。结果AB8 型树脂对黄芩苷有良好吸附分离性能,其吸附分离黄芩苷的工艺条件为:上样浓度为50 mg/ml（生药量）,上样液PH值为4，吸附流速为4BV/h ,上样体积为6BV，洗脱剂为5倍量树脂柱体积50％乙醇且洗脱剂的pH值为8。结论AB8 型大孔吸附树脂在所确定的工艺条件下,纯化黄芩苷效果良好,黄芩苷纯度可达90%左右。
       关键词：黄芩苷；  大孔吸附树脂；  纯化
       Research on the Purification of Baicalin of Scutellaria baicalensis Georgi.by AB8 Macroporous Resin
       XUAN Han， CHEN Jun ， DU  Fengyu ， REN  Xiaofeng ， CHEN  Hongbin
       （School of Biological and Environmental Engineering,Jiangsu University, Zhenjiang,Jiangsu 212013, China）
       Abstract：ObjectiveTo set up the method for purification of baicalin from Scutellaria baicalensis Georgi.by AB8 macroporous resin . MethodsThe process technology for purification of baicalin with AB8 macroporous resin was selected by dynamic absorption ratio through orthogonal tests.ResultsThe AB 8 macroporous resin owned optimum absorption and elution ability.The optimum absorption conditions were the sample concentration of 50 mg ・ml1 , the PH of sample at 4, the current velocity  of  4BV ・h1 , of eluant of 50 % ethanol（5BV）and the pH of eluting reagent at 8 .ConclusionThe AB 8 macroporous resin can be used to purify baicalin successfully , the purity of baicalin is about 90 %.
       Key words：Baicalin;   Macroporous resin;   Purification
   
　　黄芩是唇形科植物Scutellaria baicalensis Georg.的干燥根, 其性寒味苦, 具有清热燥湿、泻火解毒的功效, 它的主要有效成分黄芩苷(baicalin) 具有抑菌、清热、降压、镇静、抗炎、解毒等作用［1］。大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的新型吸附剂，是继离子交换树脂之后又一新兴的介质。近年来已广泛应用于天然植物中活性成分,如皂苷、黄酮、内酯、生物碱等大分子化合物的提取分离［2］。本实验主要对AB8大孔吸附树脂纯化黄芩苷的工艺进行研究。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器JASCOLC1500高效液相色谱仪；JASCOW1575紫外检测器；Buchi R200型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；METTLER AE240分析天平(上海梅特勒托利多仪器有限公司)；紫外可见分光光度计；THZC摇床(江苏太仓市华美生化仪器厂)；Sartorius BP2112D 型电子天平(德国赛多利斯公司)；BU G25212 型超声波清洗机。
       1.2  试药 黄芩药材(购自江苏江扬国药有限公司)；黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所提供)；树脂AB8、S8、NKA9 (南开大学化工厂)；高效液相用甲醇为色谱纯；高纯水；其它试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1   含量测定
       2.1.1   紫外分光光度法精密称取黄芩苷对照品4.96 mg，用70％乙醇定容至10 ml,摇匀，作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.05，0.1，0.15，0.2，0.25 ml于10 ml容量瓶中，再用70％乙醇定容至刻度，以70％乙醇为空白，于278 nm处测定吸光度［3］。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程：A＝70.396C＋0.021 7，r＝0.999 3（n=5），线性范围为2.48～12.4 μg/ml。样品测定后按此回归方程计算。
       2.1.2  高效液相色谱法  色谱条件：色谱柱为sinochrom(C18 ,250 mm ×4.6 mm ,5 μm) ;柱温40.0℃;流速0.8 ml/min;流动相为甲醇∶0.2％磷酸水溶液(50∶50) ;测定波长280 nm；理论塔板数按黄芩苷峰计算不低于2 500［3］。标准曲线的制备：精密称取黄芩苷对照品3.18 mg, 加甲醇定容至10 ml,摇匀，作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 ml至10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μl，测定峰面积。以峰面积对进样量回归，得回归方程：Y=3 541 229.41X + 29 261.55，r=0.999 9(n=5)，线性范围为0.063 6～1.272 μg。样品测定后按此回归方程计算。
       2.1.3  上柱液的制备  称取黄芩粗粉（20目）,分别加10倍量和8倍量水回流提取2 次,1.5 h/次,提取液滤过,合并,部分浓缩,加浓盐酸调pH为1，80℃保温30 min，静置，离心20 min (5 000 r/min) ，取沉淀加适量纯化水，加40%氢氧化钠调pH为6，抽滤, 加水定容到一定体积,即得上柱液。
       2.2  大孔吸附树脂选择
       2.2.1  大孔吸附树脂的预处理乙醇湿法装柱,用乙醇在柱上流动清洗,不时检查流出的乙醇液,至乙醇液与水混合(1 ∶5) 不呈白色浑浊为止,然后以大量蒸馏水洗去乙醇至无醇味。
       2.2.2  静态吸附量考察分别精密称取预处理过的大孔吸附树脂NKA9 , S8 ,AB8 各1 g（湿重）置于100 ml锥形瓶中,分别加入10 ml黄芩提取溶液(含生药量100 mg・ml1) ,室温下置摇床中于60 r/min下振摇24 h，使之充分吸附，取上清液测定其中总黄酮的含量，计算各树脂的静态吸附量,结果见表1。静态吸附量(mg/g)=(上样液浓度- 吸附剩余液浓度)×上样液体积/树脂质量
       2.2.3  静态解吸量考察取2.2.1项下已吸附过的树脂，分别加入70%乙醇20 ml，室温下置摇床中于60 r/min下振摇24 h，使之充分解吸，取上清液测定其中总黄酮的含量，计算各树脂的静态解吸量,并根据静态吸附量计算解吸率。结果见表1。静态解吸量(mg/g)=(洗脱液浓度×洗脱液体积)/树脂质量解吸率=静态解吸量/静态吸附量×100%综合以上实验,表明3种树脂中AB8型大孔树脂对总黄酮吸附量虽然不是最大,但是解吸率最高, 因此选用AB8树脂对黄芩提取液中黄芩苷进行纯化。
       表1  不同类型的大孔吸附树脂对黄芩苷吸附效果的影响（略）
       2.2.4  大孔吸附树脂AB8吸附动力学实验取经过预处理过的AB8大孔吸附树脂1.00 g（湿重），置锥形瓶中，加入20 ml黄芩提取液和20 ml蒸馏水，在30℃下于摇床中振摇24 h，使之充分吸附，根据吸附前后溶液中各成分浓度的差值，计算出吸附量。测定树脂在 t 时刻 (  t = 0.5 ,1，2 ,3 ……6 h)吸附量 (mg/ g) ,得吸附动力学曲线［4］。结果见图1。
       图1  AB8树脂的吸附动力学曲线（略）
       如图1可知：AB8树脂对黄芩苷的吸附，起始阶段吸附速率较大且两小时达到平衡，属于单分子层吸附。快速吸附在工业上是很有利的，可缩短生产周期。
       2.2.5  AB8树脂等温吸附线的测定 称取0.5 g已处理过的AB8树脂，共8份，分别置于150 ml具塞三角瓶中，分别加入相同浓度（50 mg生药量/ml），不同体积（4，6，8，10，14，18，20，22ml）黄芩提取液，在30，40，50℃下于恒温振荡器内吸附，以分光光度法测定溶液中黄芩苷的浓度，至黄芩苷浓度不再变化［5］。液相吸附常用Langmuir和Freundlich方程表示其平衡关系。实验结果表明采用Langmuir方程拟合的相关系数较高，对于实验温度30，40及50℃，相关系数r分别为0.976 3，0.987 8及0.990 4，而Freundlich方程的相关系数在实验温度30，40℃及50℃条件下为0.968 3，0.945 6，0.968 3，表明树脂的吸附符合langmuir单分子层吸附理论。
       2.2.6  最大动态吸附量考察  精密称取AB8树脂5 g (湿重) ,装柱,柱径高比为1∶10；柱体积约8 ml。徐徐注入含生药量为50 mg/ml的黄芩提取液,上柱流速调节为4BV/h ,分管收集流出液,每管10 ml，测定流出液中黄芩苷的含量［6］。得穿透曲线结果见图2。
       图2  黄芩苷穿透曲线（略）
       由图2结果可知：上样至第5份时泄漏百分率超过5%;从穿透曲线可以看出第6份残留液中黄芩苷的浓度明显增加,说明上样至第6份时黄芩苷开始明显泄漏,故确定最大上样量为6BV，浓度为50mg/ml黄芩提取液。动态最大吸附量为78.44 mg/g。
       2.3  大孔树脂吸附条件的优化为考察上样时样品溶液的浓度、上样液pH值、上样流速这3个条件对AB8树脂吸附黄芩苷的影响［7］, 在预实验的基础上按L9(34)表进行了正交实验。精密称取AB8树脂5 g (湿重) ,装柱,柱径高比为1∶10，上样量为2.5 g黄芩药材提取液，按表2的条件分别上样并计算对应的树脂的吸附量,实验结果及方差分析分别见表2~3 。
       表2  直观分析（略）
       表3  方差分析（略）
       由表4可知,上样浓度、上样流速对黄芩苷的吸附量无显著性影响,上样液pH值对黄芩苷的吸附量有显著性影响,根据实验数据,最后确定最佳吸附条件为A 2 B1 C3 ,即上样浓度为50 mg/ml(生药量),上样流速为4BV/h，上样液得pH值为4。
       2.4   验证实验精密称取AB8树脂5 g(湿重) ,装柱,柱径高比为1∶10，上样量为2.5 g黄芩药材提取液，按正交实验筛选出的条件上样，计算树脂的吸附量。结果见表4。
       表4  验证实验结果（略）
       由表4可知，根据正交实验筛选出的吸附条件进行动态吸附，树脂的吸附量较大。
       2.5  洗脱剂的选择按2.2.6 项中已吸附饱和的树脂,用不同浓度的乙醇进行动态洗脱,先用100 ml（12.5BV）水洗脱,再依次用10 %乙醇, 30 %乙醇，50 %乙醇，70 %乙醇，95 %乙醇各100 ml（12.5BV） 洗脱,洗脱流速为3BV/h,分段收集洗脱液,每管25 ml，约合3BV,测定其中黄芩苷的含量［7］。以流份序号为横坐标,黄芩苷含量为纵坐标,绘制梯度洗脱曲线。 由图3得出，10％乙醇，30％乙醇，50％乙醇洗脱液中都含有黄芩苷，由于低浓度的乙醇洗脱液需要较大用量才能将所吸附的黄芩苷洗脱出来，因此选用50％乙醇为洗脱剂。
       1～4为水洗脱液，5～8为10％乙醇洗脱液，9～12为30％乙醇洗脱液，13～16为50％乙醇洗脱液，17～20为70％乙醇洗脱液，21～24为95％乙醇洗脱液
       图3  黄芩苷动态洗脱曲线（略）
       2.6  洗脱剂pH值的确定  取已处理好的树脂，按正交实验筛选出的条件上样后，先用水洗至无色，然后用6BV,pH分别为4，6，8的50％乙醇洗脱，测定洗脱液中黄芩苷的含量。由表5可知，50 ml含50 mg/ml黄芩提取液上柱后，pH为8的洗脱剂对黄芩苷的洗脱量最大，洗脱率达91.70％，黄芩苷的纯度达到90.31%，回收率为68.44%。
       2.7  解吸曲线的测定取已处理好的树脂，按正交实验筛选出的条件上样后，先用水洗至无色，然后用pH为8的50％乙醇洗脱，每树脂床体积收集1份，测定其中黄芩苷的含量。以洗脱体积为横坐标，洗脱量为纵坐标，绘制洗脱曲线。由图4可知，黄芩提取液上柱后，5BV pH值为8的50％乙醇即可将树脂吸附的黄芩苷基本洗脱下来。
       表5  不同pH的洗脱液中黄芩苷含量（略）
       回收率 = 洗脱液中黄芩苷量/上样液中黄芩苷量×100%
       图4  黄芩苷洗脱曲线（略）
       2.8  大孔吸附树脂的再生实验表明，经过预处理的AB8树脂对黄芩苷的吸附率为84.70％，树脂使用后，用95%乙醇洗脱至无色时，然后以大量的纯化水洗去乙醇, 树脂柱即已再生，可进行下一次的吸附分离，其对黄芩苷的吸附率为84.64％。说明树脂再生能力较强。
       　　3  结论
       AB-8树脂孔容体小,体积比表面积大(每毫升湿树脂所具有的比表面积 m2/ml),吸附量较大。正交实验表明：黄芩提取液浓度在50 mg/ml（生药量），pH为4，上样流速为4BV/h 时吸附效果最好，饱和吸附量可达78.44 mg/g(湿重)，将洗脱液pH值调至8时，洗脱效果最好，样品纯度可达90%左右，回收率为68.44％。树脂可以再生利用，成本较低，生产周期较短，适宜大规模生产。
       　　参考文献：
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       ［3］  周德庆，曾  骆.黄芩总黄酮的提取工艺研究［J］.华西药学院杂志，2002，18（1）：78.
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       (江苏大学生物与环境科学学院，江苏 镇江  212013)