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       【关键词】  黄芪；布比卡因；神经毒性；p38激酶
       我国产科病人多采用椎管内麻醉进行剖宫产手术麻醉或分娩镇痛等，其中部分病人出现由于局麻药神经毒性反应引起的不同程度的神经系统并发症。国内陈秉学教授收集2003～2005年间广东省三家三级乙等医院采取腰-硬联合阻滞麻醉行剖宫产术800例，其中7例出现永久性周围神经损伤（陈秉学.《腰硬联合麻醉并发神经害·局麻药毒性》.2006广东省麻醉学术年会论文）。黄芪具有清除自由基，抵抗脂质过氧化反应，保护SOD酶活性的功能，从而发挥神经保护作用［1］，而黄芪对局麻药的脊神经毒性是否有保护作用未见报道。本实验制作孕鼠椎管内注药模型，通过观察黄芪对布比卡因脊神经毒性损伤后背根神经节p38激酶的影响，探讨黄芪对局麻药脊神经毒性保护作用的机制。
       1 材料
       1.1 动物
       健康雌性SD大鼠，体重180～200 g，由广东省实验动物中心提供。在室温18～28℃，相对湿度40%～70%的屏障系统内饲养，不控制饮食，发情期将雌性大鼠和雄性大鼠(比例为5∶1)同笼饲养，每日行阴道涂片，镜下见到精子作为妊娠的第1日。选用妊娠17日孕鼠为研究对象。
       1.2 药品和试剂
       黄芪注射液（成都地奥九泓制药厂），盐酸布比卡因粉剂（sigma公司，批号014252803），兔抗鼠p38多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），鼠尾光照测痛仪（山东省科学设备站）。
       2 方法
       2.1 实验分组
       选取成功的鞘内注射模型SD孕鼠24只，随机分成3组。布比卡因组8只，鞘内注入布比卡因，腹腔注射生理盐水；黄芪治疗组8只，鞘内注入布比卡因，腹腔注射黄芪注射液；对照组8只，鞘内和腹腔均注入生理盐水。〔鞘内注入2%布比卡因30 μl，各组鞘内注药完毕后，用10生理盐水冲洗导管。腹腔注入黄芪注射液8 ml/（kg·d），连续注药3 d。〕
       2.2 孕鼠鞘内注射模型制备
       10％水合氯醛腹腔注射麻醉下（250 mg/kg），拇中2指按压骶骨两侧固定，食指按在双侧骶骨前缘连线正中点皮肤上，摸出L3～L4间隙（由骶骨中线向上摸，可摸到一较突出棘突，为L3棘突，其下间隙为进针点），于L3～L4椎间隙向头侧植入置入PE-10导管2 cm。固定导管，埋于皮下。植入过程中见清亮脑脊液从导管内缓慢流出，可证实在蛛网膜下腔。维持孕鼠存活2 d。之后按实验设计分别给药。
       2.3 分离背根神经节
       最后注药结束24h后，各组孕鼠行断颈处死置于冰块上。将孕鼠背毛剪去，肥皂水清洗局部，2％碘酊和75％酒精消毒，无菌操作行后背部正中切口，切开皮肤、皮下组织，钝性分离脊柱两旁肌肉，暴露腰底段脊柱棘突与横突，在16倍简易手术显微镜下去棘突、椎板及双侧横突，蚊钳咬开椎间孔，剪去背根神经节两端脊神经干，保留膨大部分，即为背根神经节。
       2.4 甩尾反应潜伏期的测定（tail-flick test，TF）
       每次注药后24h测定孕鼠热辐射甩尾反应潜伏期(TFL)，将高强度光束照射到鼠尾背部，从开始照射到孕鼠产生甩尾反应的时间为TFL。为防止组织损伤，分别照射鼠尾的中下1/3不同部位，如果光照时间到达10 s时，孕鼠仍不甩尾，则停止照射，这时TFL记作10 s，连续测定3次，每次间隔30 s，取其平均值。用最大效应百分比(MPE)评价运动功能的阻断，MPE=(注药后TFL-TFL的基础值)／(10.0-TFL的基础值)×100％ 。
       2.5 Western blot分析
       p38激酶水平分离的背根神经节加入100μl组织裂解液（0.1mol/L NaCl，0.01mol/L Tris-HCl，0.001 mol/L EDTA，0.001mg/ml Aprotinin，0.001mg/ml PMSF）置于研磨器中匀浆。①蛋白定量；②电泳：进行7.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）；③转印；④一抗结合；⑤二抗结合；⑥显色，照相；⑦检测：显色的NC膜经UVP扫描仪扫描成像，通过计算峰下体积代表蛋白质表达量。
       2.6 统计学处理
       采用统计学软件SPSS13.0进行分析，计量资料±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
       3 结果
       3.1 各组每次注药24h后MPE的比较
       见表1。从表1可看出，布比卡因组在注药3 d后，与对照组和黄芪治疗组相比，孕鼠的甩尾潜伏期的MPE明显延长（P<0.01）。其他时间点组间比较未见明显差异。表1  各组每次注药24h后MPE的比较（略）
       3.2 孕鼠背根神经节内p38激酶的变化
       见表2。从表2可看出，孕鼠背根神经节内p38激酶的水平在椎管内注入布比卡因后升高，与对照组比较，布比卡因组（P<0.01）和黄芪治疗组（P<0.05）背根神经节内p38激酶的水平均有显著差异。与布比卡因组比较，黄芪治疗组背根神经节内p38激酶的水平明显降低（P<0.05）。表2  孕鼠背根神经节内p38激酶的变化（略）
       4 讨论
          
       黄芪味甘、微温，归脾、肺经，李时珍称其为“补气之长”。具有补肾固本、健脾补肺和益卫固表等功效。从中医辩证施治的角度分析，产妇分娩时耗气伤血，产后气血俱虚，腠理不密，风寒湿邪乘虚而入，流注经络、关节，使气血运行受阻，瘀血阻于经络、筋骨之间，不通则痛。黄芪温能散寒，补气能行血，血行则淤散，通而不痛。产妇椎管内麻醉后出现的神经系统并发症，表现为下肢的感觉和（或）运动功能障碍，大致属中医学“痿证”的范畴，证属气虚络阻、血瘀，兼肝肾精血的亏损。黄芪既能补气升阳以启动下焦之阳气，又能补气活血以促进经络之通畅［2］。
       
       西医分子生物学方面的研究发现，黄芪具有抗神经细胞凋亡的作用。有研究报告，将黄芪用于动物未成熟脑缺血缺氧条件下的治疗，病理学显示，黄芪治疗组脑海马CAI区神经细胞的凋亡率比对照组明显减少，脑水肿减轻，caspase-3 mRNA表达峰值均明显降低，提示黄芪能有效的抑制细胞中caspase-3 mRNA表达，从而达到保护神经细胞的作用［3］。
       
       目前关于局麻药引起的脊神经毒性损伤机理尚未完全清楚，研究认为可能与神经细胞内Ca2+浓度升高、脑脊液中谷氨酸含量增加及神经细胞膜完整性破坏等有关。近年有学者发现局麻药可引起局部神经细胞凋亡，其机理可能与丝裂原性活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族磷酸化密切相关。MAPK家族包括三大成员：ERKs(extracellular signal-regulated kinases)、JNKs(c-Jun N-teminal kinases)、p38激酶。Tan等［4］发现丁卡因通过激活MAPK系统可诱导周围神经细胞凋亡，丁卡因诱导细胞膜内外一系列信号转导， ERKs生存信号分子与JNKs死亡信号分子激活失衡，即减弱ERK磷酸化，强化JNK磷酸化，同时激活p38激酶，最终导致Ca2+内流引起神经细胞死亡。Philipp等［5］也发现利多卡因可激活与细胞凋亡相关的p38激酶，引起线粒体胞膜破坏，释放细胞色素c，启动半胱天冬酶复合物形成，进一步活化caspase-3，产生DNA碎片，导致周围神经细胞凋亡。
       
       本研究发现，孕鼠椎管内注入布比卡因后，甩尾潜伏期延长（P<0.01），背根神经节p38激酶明显升高（P<0.01），这与其他研究者的结果一致，椎管内注入布比卡因导致了脊神经毒性损伤。黄芪注射液治疗后，与布比卡因组比较，背根神经节p38激酶明显降低（P<0.05），甩尾潜伏期缩短。可见，黄芪注射液可以降低背根神经节p38激酶，对布比卡因引起的脊神经毒性有明显的保护作用。黄芪注射液是否通过降低p38激酶而减轻了神经细胞凋亡还有待我们进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］任宪盛, 冷向阳, 杨有庚，等. 黄芪对大鼠实验性脊髓损伤的神经保护作用［J］.中国临床康复,2006,10(7):31.
       
       ［2］朱树宽. 黄芪善治脊髓损伤性截瘫［J］.中医杂志,2000,41(6):330
       
       ［3］贾瑞喆, 蒋犁, 乔立兴. 黄芪对新生鼠缺氧缺血脑损伤后皮质的治疗作用［J］. 中国中西医结合杂志,2005,25(1):54.
       
       ［4］Tan Z.M, Shuiji D, et al. Involvement of the mitogen-activated protein kinase family in tetracaine-induced PC12 cell death［J］.Anesthesiology, 2002,96(5):1191.
       
       ［5］Philipp L, Ingrid H, et al. Mitigation of direct neurotoxic effects of lidocaine and amitriptyline by inhibition of p38 mitogen-activated protein［J］.Anesthesiology, 2006,104(6):1266.