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       【摘要】 
       目的观察银杏叶提取物对肺纤维化模型大鼠肺组织中结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响。方法96只健康Wistar大鼠随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、强的松组(C组)和银杏叶提取物干预组（D组），每组各24只，除A组外，其余各组采用博莱霉素复制大鼠肺纤维化模型，造模第2天起，D组用银杏叶提取物灌胃，C组用强的松混悬液灌胃，A、B组用生理盐水灌胃。每组分别于7，14和28 d随机处死8只大鼠，制备肺组织切片，用免疫组化SABC法分别检测各时间点各组大鼠肺组织中的CTGF的表达。结果与A组比较，各时间点B、C、D组CTGF表达均显著增高（P＜0.01）。与B组比较，各时间点，C、D各组CTGF表达均低于B组（P＜0.01或P＜0.05）。结论CTGF可能在肺泡炎、肺纤维化的发生发展过程中起着重要的作用，其表达程度与肺纤维化的程度密切相关；银杏叶提取物可能通过抑制CTGF的表达对肺组织起着修复及保护作用。
       【关键词】  肺纤维化；结缔组织生长因子（CTGF）；银杏叶提取物
       Effect of Ginkgo Biloba Extract on CTGF in Experimental Pulmonary Fibrosis of Rats
       LIU Xia, XU Zhaoxia, CAO  Xiurong, DING Mingqiao
       1.Wuhan Jianmin Pharmaceutical.Groups Corp, Wuhan 430052,China; 2.Shanghai University of TCM, Shanghai 201203, China; 3.Hubei Food and Drug Administration, Wuhan 430071, China; 4.Wuhan No.5 Hospital, Wuhan 430050, China
       
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of ginkgo biloba extract on CTGF in experimental pulmonary fibrosis of rats. Methods96 healthy Wistar rats, weighing from 180～220gram, were randomly divided into four groups(n=24,each): normal control group(group A), model group(group B), prednisone group(group C), Chinese drugs ( group D).The rat model was induced by blyomicin and respective medicine was given to each group. Every group was sub-divided into three groups (n=8) which was killed on the 7th, 14th and 28th day respectively,and the expression of CTGF in lung of the rats was detected.ResultsThe expression of CTGF in the lung tissue in group C. D in the each phase was lower than that in group B respectively (P＜0.05or 0.01)ConclusionGinkgo biloba extract can decrease the expression of CTGF in lung tissue.
       Key words：Pulmonary fibrosis；  CTGF；  Ginkgo biloba extract
       
       现代研究发现，多种细胞因子、生长因子之间的调控失衡是特发性肺纤维化的发病机制之一。其中，结缔组织生长因子（connective　tissue growth factor, CTGF)作为转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）的下游因子，是一种新的可刺激成纤维细胞增殖和分泌胶原的生长因子，可能是肺纤维化发生过程中的一个关键调节因子。银杏叶提取物对肺纤维化有一定疗效，但其作用机制尚未完全明了。本实验采用免疫组化SABC法检测CTGF在博莱霉素致大鼠肺纤维化模型肺组织中表达及银杏叶提取物对其表达的影响。旨在探讨CTGF与肺纤维化的关系及银杏叶提取物对肺纤维化模型大鼠肺组织起保护作用的可能机制。
       1  器材与方法
       1.1 药物
       博莱霉素(商品名：平阳霉素，Bleomycin A5, BLMA5。批号：040601，天津太河制药有限公司生产)，每支8 mg，用1 ml生理盐水配置备用。醋酸强的松片（广东华南制药厂生产，批号041201），在使用时用蒸馏水溶解，配成0.32 g/L混悬液备用。银杏叶提取物选用依康宁片（扬子江集团有限公司生产，批号：05012801，每粒含总黄酮醇苷19.2 mg，萜类内酯4.8 mg，剂量按照总黄酮醇苷与萜类内酯总剂量计算），用蒸馏水溶解制成0.675 g/L混悬液备用。
       1.2 试剂
        
       DAB、SABC免疫组化试剂盒、抗CTGF抗体、苏木素均购自武汉博士德生物工程有限公司；PBS溶液、4%多聚甲醛由湖北中医学院实验中心提供；双氧水及乙醇购自于武汉市江北化学试剂有限责任公司；环氧树脂812，由湖北省武警总医院病理室提供。
       1.3 仪器
       显微摄影装置为Olympus PM-10AD，Olympus光学显微镜。
       1.4  动物分组、造模及喂养
       96只健康Wistar大鼠，体重（180±20）g，清洁级，雌雄不限，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，动物合格证号TJLA［2005］019，于实验前一周一次性购进，按清洁级标准饲养于安静、温暖且避强光的环境中，自由饮水进食。
       
       动物分组：96只大鼠随机分成正常对照组（A组）、博莱霉素组（B组）、强的松干预组（C组）、银杏叶提取物干预组（D组），除A组外，其余各组采用博莱霉素复制大鼠肺纤维化模型。
        模型制作：10%的水合氯醛10 mg/(kg·bw)腹腔注射麻醉大鼠，将其仰卧固定于大鼠实验台上，切开颈部皮肤，分离气管，正常组一次性气管内注入生理盐水1 ml/(kg·bw)， 其余3组一次性气管注入等容积博莱霉素5 mg/(kg·bw)，注射后立即将动物直立并旋转，使药物在肺内均匀分布，然后缝合皮肤，置动物于实验动物室内喂养。
        给药方法：造模第2天起，D组用银杏叶提取物(浓度0.675 g/L，剂量为10 ml/kg·bw)灌胃，1次/d，C组用醋酸强的松混悬液(浓度为0.32 mg/ml，剂量为10 ml/kg·bw)灌胃，1次/d，A、B组每天用生理盐水(10 ml/kg·bw)灌胃，1次/d。
       1.5 标本的采集及制备
       各组分别于造模后第7，14，28天随机处死8只大鼠，开胸暴露肺脏，将右肺浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，将肺组织横切成3 mm厚的薄片，继续用4%多聚甲醛固定72 h，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡定向包埋，连续切片，厚度6 μm，每隔5片取一片，每份组织取10片备用，然后在60℃的温水中充分展开，用玻片贴片。
       1.6  CTGF表达的检测
       免疫组化染色具体步骤严格按试剂盒说明操作。
       1.7  结果判定
       CTGF抗体表达，以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。免疫组化染色切片在显微镜下放大400×下，各组片中上、中、下、左、中、右各处随机选取9个视野，观察染色情况，记数每个视野中的细胞总数和阳性细胞数，计算其阳性细胞率，并分别求其平均值。
       1.8 数据处理
       各组数据均采用±s表示，实验数据采用PEMS3.1统计软件包进行处理，各组间差异采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。
       2 结果
          
       与A组比较，各时间点B，C，D组CTGF表达均显著增高（P＜0.01）。与B组比较，各时间点，C，D各组CTGF表达均低于B组（P＜0.01或0.05）。各组大鼠肺组织CTGF表达量见表1。表1  各组大鼠肺组织CTGF表达阳性细胞率的比较（略）
       3 讨论
        CTGF是Bradham等［1］于1991年首次在人的脐静脉内皮细胞条件培养基中发现的细胞因子。它是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽，属即刻早期基因CCN家庭成员之一，广泛存在于成人各种组织器官，如：心、脑、肺、肝、肾等。CTGF具有促进细胞增殖、合成胶原、促进细胞黏附、增生和细胞外基质合成等作用，并参与机体组织的创伤修复过程，是一种促纤维生长因子。在生理状态时，机体组织细胞可有基础量CTGF的分泌；病理状态下，CTGF过度表达与某些增生性或纤维化性疾病的发生密切相关。当纤维化发生时，CTGF过度表达并通过调控I型胶原α2，启动转录起始位点上游379 bp出CTGF的应答元件，介导TGF-β或通过自分泌作用刺激胶原合成，从而导致细胞外基质中纤维连接蛋白（FN）和胶原蛋白的过度沉积［2］。
       
       大量的文献报道认为TGF-β是促进肺、肝、肾等脏器纤维化发生发展的关键因子［3］，是组织纤维化过程中始发的致纤维化因子。但近年来的研究表明，TGF-β具有诱导胚胎发育、细胞增生、分化、凋亡、阻止基质降解和在一定的条件下促进纤维化的作用。其单独的作用并不能引起纤维化，事实上，TGF-β促进脏器纤维化的信号是通过CTGF向下转导的［4］。CTGF是介导TGF-β1促纤维化作用的一个重要的下游因子，应用反义CTGF技术或抗CTGF中和抗体可以阻断TGF-β1引起的促纤维化效应［5］。还有研究发现在小鼠的皮肤纤维化模型中，TGF-β1可以引起短期的纤维化组织增生，而同时注射CTGF则可以引起持续稳固的纤维组织增生［6］。近期有实验进一步证实［7］，CTGF蛋白的表达与肺纤维化的程度密切相关，且作为上游因子TGF-β1在肺纤维化中的表达规律与CTGF几乎完全一致，并与CTGF升高成正比。
       
       本实验中，我们观察到CTGF蛋白在博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型肺组织中的表达显著增加，高于正常组和强的松、银杏叶提取物干预组，进一步证实了CTGF的表达与肺纤维化的程度密切相关。同时也观察到银杏叶提取物能有效减少CTGF在肺组织中的表达。故我们认为，CTGF在肺纤维化发生发展过程中可能起着重要作用；银杏叶提取物可能通过抑制肺组织中CTGF蛋白的表达而对肺纤维化大鼠起治疗作用。由于CTGF在正常生理状态下表达水平较低，生物学效应单一，又可能在肺间质纤维化的过程中起着极其重要的作用，故开发能抑制CTGF的产生和激活的药物将会有可能逆转肺间质纤维化，为探索纤维化疾病的治疗策略提供新的思路。
       【参考文献】
         　　［1］何明，张晓梅，苑惠青，等．银杏叶提取物治疗肺纤维化的临床研究［J］．中国中西医结合杂志，2005，25（3）：222.
       
       ［2］Holmes A,Abraham DJ, Susan S,et al.CTGF and AMADs, Maintenance of sclerpderma phenotype is independent of SMADs signaling ［J］.J Biol Chem,2001,276:10594.
       
       ［3］Flanders KC.Smsds as a mediator of the fibrotic response.Int J Exp Pathol,2004，85:47.
       
       ［4］Grotendoral GR,Rahmanie H, Duncan MR Combinatorial aignaling pathways delermine fibroblast proliferation and myofibroblast differentialion［J］. FASEBJ, 2004，8:469.
       
       ［5］Crean JKG,FinelayD,Murphy M,et al.The role of P42/P44 MAPK and protein kinase B in connective tissue growth factor induced extracelluar matrix protein Production,cell migration,and action cytoskeletal rearrangement in human mesangial cells［J］.J Biol Chem,2002,277(46):44187.
       
       ［6］Mori T,Kawara S,Shinozki M,et al.Role and interaction of connective tissue growth factor with transforming growth factor-β in persistent fibrosis:a mouse fibrosis model［J］.J Cell Physiol,1999,181(1):153.
       
       ［7］叶旭军，徐启勇，叶燕青. 结缔组织生长因子在大鼠肺纤维化模型中的蛋白表达［J］. 微循环学杂志， 2004，14（1）：16.