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       【关键词】  绞股蓝丹胶囊；,,制备工艺；,,质量标准；,,绞股蓝总皂苷；,,原儿茶醛；,,薄层色谱法；,,分光光度法
       摘要：目的介绍绞股蓝丹胶囊的制备及成品的质量标准。方法以该制剂中绞股蓝和丹参两味主药中的指标成分绞股蓝总皂苷和丹参水溶性物质总酚酸类成分进行定性鉴别和定量测定。结果应用薄层色谱法定性分析，两种色谱均分离清晰，重现性好；以分光光度法测定绞股蓝总皂苷和丹参总酚酸类成分含量，方法稳定、可靠、切实可行。结论其定性、定量方法准确、专属性强、重现性好，可供制定质量标准使用。
       关键词：绞股蓝丹胶囊；  制备工艺；  质量标准；  绞股蓝总皂苷；  原儿茶醛；  薄层色谱法；  分光光度法
       绞股蓝丹胶囊是我院根据临床需要和实践经验，以补气益气和活血化瘀的中医理论为依据，研制的由绞股蓝、丹参、黄芪组成的中药制剂。经药理、药效学研究，本胶囊有明显抑制血栓形成［1］、抗自由基及保护脑缺血再灌注脑损伤的作用［2］ 。因此，对缺血性脑卒中有一定的预防和治疗作用。为保证制剂的质量和临床疗效，笔者以方剂中君、臣二药绞股蓝和丹参中的绞股蓝总皂苷和丹参水溶性物质总酚酸类成分为指标成分，进行定性鉴别和定量测定。现报道如下。
       　1  器材
       1.1  仪器与器材TU1901 双光束紫外可见反光光度计（北京普析通用仪器有限公司）， 旋转蒸发仪（德国 Heidolph) ， 恒温水浴， 层析柱（1.0 cm×15 cm)，蠕动泵。
       1.2  试剂与试药人参皂苷Rb1和原儿茶醛标准品（均购自中国药品生物制品检定所），D101大孔树脂（安徽三星树脂有限公司），薄层层析硅胶（青岛海洋化工有限公司），香草醛（SIGMA) ， 高氯酸 、冰乙酸、 NaNO2 、 Al(NO3)3 等均为分析纯试剂。
       　　2  药物及制备
       2.1  处方组成绞股蓝、丹参、黄芪。
       2.2  药材来源绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝的干燥全草，由湖北神龙架林区科技开发公司提供；丹参为唇形科鼠尾草属植物干燥根,丹参饮片购自河北安国药材市场 ；黄芪为豆科植物,以干燥根入药,黄芪饮片为内蒙黄芪，购自河北安国药材市场。
       2.3  制法将3味药用水浸泡2 h，加热煎煮3次。第1次加10倍量水，煎煮1 h；第2次加8倍量水，煎煮45 min；第3次加6倍量水，煎煮30 min。每次煎煮后过滤，合并滤液，加热浓缩至相对密度1.10~1.20  g/ml，进行喷雾干燥成粉剂。加辅料后混匀，充填于 1号胶囊内，包装0.3 g/粒，密封包装。　
       　　3  绞股蓝的定性鉴别和含量测定  ［3~5，9］
       以绞股蓝中的绞股蓝总皂苷为指标成分 进行定性鉴别和含量测定 。以人参皂苷Rb1为标准，采用薄层色谱法进行定性分析，以分光光度法测定进行定量分析。
       3.1  样品制备
       3.1.1   绞股蓝对照药材样品制备精密称取绞股蓝生药粉2.0 g，置带塞锥形瓶中，加入乙醚50 ml振摇脱脂脱色，弃乙醚，药渣挥干；加水饱和正丁醇100 ml，萃取（密塞，充分振摇，超声波处理30 min），放置过夜。滤纸过滤，弃初滤液，精密吸取续滤液50 ml，置旋转蒸发仪减压回收正丁醇。残留物加3 ml蒸馏水溶解后，将样品上已预处理好的D101大孔树脂柱（内径1.0 cm×高15 cm）。先用蒸馏水约100 ml洗柱，再用20%乙醇去杂洗涤，洗至流出液无色（约100 ml）弃去，最后用75%乙醇洗脱（流速1 ml/min,充分洗脱）。收集洗脱液（约60 ml）， 减压浓缩洗脱液，挥干，回收乙醇。残渣加甲醇溶解，转移定容至2 ml容量瓶中。4℃ 冰箱保存，待用。
       3.1.2  供试品制备 取本品 10 粒，去胶囊取出药粉。倒入带塞锥形瓶中，加入甲醇浸提2次（30 ml×2），密塞，充分振摇，超声波处理30 min合并浸提液，滤纸过滤，置旋转蒸发仪减压回收甲醇；残留物加水饱和正丁醇60 ml溶解，用正丁醇饱和过的氢氧化钠溶液洗2次（30 ml×2），密塞，放置过夜。 弃氢氧化钠溶液 ，精密吸取正丁醇萃取液30 ml， 减压回收正丁醇；残留物加3 ml蒸馏水溶解后，将样品上已预处理好的D101大孔树脂柱（内径1.0 cm×高15 cm）。先用蒸馏水约100 ml洗柱，再用20%乙醇去杂洗涤，洗至流出液无色（约100 ml）弃去，最后用75%乙醇洗脱，流速1 ml/min,充分洗脱。收集洗脱液（约60 ml）。 减压浓缩洗脱液，挥干，回收乙醇。残渣加甲醇溶解，转移定容至2ml容量瓶中。4℃ 冰箱保存，待用。
       3.1.3  人参皂苷Rb1对照品配制 精称人参皂苷Rb1 10.0 mg，加甲醇溶解。定容至5 ml容量瓶中。配制成2 mg/ml标准液。
       3.2  薄层层析定性分析吸取上述3种溶液各5 μl。分别点于同一硅胶 G0.5%CMCNa 薄层板上，以正丁醇醋酸乙酯水（4∶1∶5）饱和后取上层为展开剂，展开。 取出后晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液显色剂，晾干。在105℃加热至斑点显色。 结果本供试品色谱中，与标准对照品和对照药材在相应Rf值位置显相同的紫红色斑点。与对照药材色谱的其他位置斑点也完全相同。结果见图1。于365 nm紫外灯下观察，在相应位置有荧光斑点。
       3.3  绞股蓝总皂苷含量测定
       3.3.1  标准曲线制备精密吸取上述人参皂苷Rb1（2 mg/ml）对照溶液 0，25，50，100，150，200 μl，于具塞试管中。用热气挥干溶剂， 各加5%香草醛冰醋酸溶液 （新鲜配制）0.2 ml，高氯酸0.8 ml， 混匀。密塞，置60℃水浴中保温15 min，取出后立即放入冰水浴中冷却。再加冰醋酸5 ml，混匀。于分光光度计550 nm 处测定吸光值。所测含量在0～400 μg范围内具有良好线性关系。得回归方程y = 0.003 5x－0.039 9， r=0.998 8。
       3.3.2  供试品含量测定精确吸取上述精制供试品及生药对照品溶液各20 μl，置具塞试管内，以下操作同标准曲线，于550 nm处测定其吸光值，代入回归方程，求得各样品绞股蓝总皂苷含量。
       3.4  含量测定方法学考查
       3.4.1  稳定性实验将上述3.3.2项内供试品于550 nm处每隔10 min测1次吸收值，结果见表1。从表1中可看出，在60 min内吸收值仅下降1%，说明本测定方法稳定性良好。
       3.4.2  回收实验精密称取已知含量的绞股蓝丹药粉5份，每份1.0 g，倒入带塞锥形瓶中，每瓶中各加入人参皂苷Rb1（2 mg/ml）标准溶液0.5 ml,其余操作同上述供试品制备（3.1.2）及含量测定（3.3.2），计算加样回收率。结果见表2。
       　　4  丹参的定性鉴别和含量测定［6，7］
       以丹参水溶性物质总酚酸类成分为指标成分，以原儿茶醛为标准，采用薄层色谱法进行定性分析，以分光光度法测定进行定量分析。
       表1  稳定性实验结果（略）
       表2  回收实验结果（略） 
       4.1  样品制备
       4.1.1  药材对照品样品制备称取丹参生药粉2.0 g，加水120 ml浸泡2 h，于100℃水浴中热提2 h；冷却静置后,用盐酸调pH至2，充分振摇，放置过夜。滤纸过滤，取半量滤液至带塞烧瓶中， 加50 ml水饱和乙醚萃取 （密塞，充分振摇，超声波处理30 min）， 放置过夜。精密量取乙醚萃取液25 ml， 置蒸发皿中蒸干，残渣加双蒸水溶解，转移至容量瓶中定容至5 ml，4℃保存，用于定量测定； 再吸取乙醚萃取液16 ml(因分液面表层不易吸取)，置蒸发皿中蒸干，残渣加0.8 ml甲醇溶解。 4℃保存，用于薄层层析。
       4.1.2  供试品样品制备取绞股蓝丹胶囊 10 粒， 打开胶囊取出药粉，加水100 ml用盐酸调pH至2，浸泡。中间充分振摇，放置过夜。用滤纸过滤，弃初滤液。精密吸取续滤液50 ml 置带塞烧瓶中，加水饱和乙醚50 ml萃取。其余操作同上。
       4.2  薄层层析定性分析
       4.2.1  TLC标准液配制精称原儿茶醛5.0 mg，加甲醇定容至5 ml,制成1 mg/ml的溶液。作为标准对照品。
       4.2.2  TLC分析 吸取上述3种溶液（标准对照品，生药对照品及本品样品制备液）各5 μl。分别点于同一硅胶 G0.5%CMCNa 薄层板上，以氯仿醋酸乙酯苯甲酸（2.4∶2∶1∶0.6）为 展开剂， 展开。展距15 cm，取出晾干，喷以2%三氯化铁1%铁氰化钾（1∶1）混合溶液显色。结果：供试品色谱中在与对照药材和对照品色谱相应位置上显相同的普鲁士蓝色斑点。结果见图 1~2。
       图1  自左至右：标准Rb1、 绞股     蓝生药材对照品、绞股蓝丹样品  （略）
       图2  自左至右：原儿茶醛、     丹参生药材对照品及绞股蓝丹样品（略）
       4.3  丹参中水溶性酚酸类成分含量测定采用邻苯二羟基络合显色法进行分光光度法测定。
       4.3.1  标准液配制精密称取原儿茶醛（3，4二羟基苯甲醛）5.0 mg，加水溶解，并稀释至50 ml容量瓶，制成0.1 mg/ml溶液，作为标准对照品。
       4.3.2  标准曲线制备精密吸取原儿茶醛标准液（0.1 mg/ml）0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 ml于试管中，加水补至2 ml，分别加入5% NaNO2 0.5 ml,混匀；室温放置5 min，加入10%Al(NO3)3  0.5 ml ，混匀，放置5 min；各管再加入0.5 mol/L NaOH溶液5.0 ml 混匀；室温放置10 min后，以0管为空白，在分光光度计520 nm处测得吸光值。以吸光值为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程为Y=0.004 1X－0.003 0, r= 0.999 9。结果，原儿茶醛含量在0～200 μg 间有良好线性关系。
       4.3.3  丹参生药材及本供试品含量测定将已制备的丹参生药及本品样品制备液，各精密吸取0.2 ml，按标准曲线法操作，于520 nm处读吸光值（n=2）。取平均值，根据回归方程式，计算出丹参生药及本品中丹参水溶性酚酸类成分含量。
       4.3.4  稳定性实验将上述项内供试品于520 nm处每隔10 min测1次吸收值，结果在60 min内吸收值下降＜1%，说明本测定方法稳定性良好。
       5  讨论
       5.1  绞股蓝含有10余种皂苷，它们具有与人参皂苷相似的四环三萜的基本结构，其中4种与人参皂苷Rb1，Rb2，Rd及F2结构相同［9］。因此，选定以人参皂苷Rb1为标准品，参照人参皂苷的检测方法，对制剂中绞股蓝总皂苷进行定性鉴别和含量测定，作为质控标准。
       5.2  由于本制剂同时含绞股蓝与黄芪，黄芪甲苷对绞股蓝总皂苷的含量测定有干扰。参考文献［9］，用氢氧化钠溶液洗涤和大孔树脂D101净化，基本消除了黄芪中皂苷的干扰。
       5.3  丹参的主要有效成分包括脂溶性成分和水溶性成分两部分。前者以丹参酮ⅡA 为代表的醌类化合物，具有明显抗炎作用；后者以丹参素、原儿茶醛为代表的酚酸类成分，均为邻苯二羟基类化合物。本制剂取丹参水溶性成分，因此，选用原儿茶醛作为指标成分，进行定性、定量测定。采用邻苯二羟基化合物显色法的可见分光光度法［7］进行含量测定，方法简单、准确，干扰因素少，作为质量标准设定是可行的。
       5.4   在以原儿茶醛为标准品进行TLC时，为确保色谱分离清晰、重现性好，对层析时的温度、相对湿度、展开剂和显色剂进行了多种探索。结果发现，室内相对湿度对色谱质量影响明显，当室内相对湿度 ≥ 60%时，已活化时间较长的硅胶板 ，临用前最好再次加热活化，以保证层析质量。关于展开剂，试用多种组合，结果以氯仿醋酸乙酯苯甲酸（2.4∶2∶1∶0.6）［6］配制的展开剂分离效果最好。在显色剂的选用方面，有关文献均未提及使用显色剂，但展开后色谱不够清晰，采用铁氰化钾三氯化铁显色法［10］，根据酚羟基的还原性，使铁氰化钾三氯化铁试液生成普鲁士蓝沉淀的原理，用于原儿茶醛类TLC的显色。显色效果极好，灵敏度高，重复性好，值得推广。
       　参考文献：
       ［1］  池明宇，张澄波，郑贵元，等.绞股蓝丹对大鼠实验性体内血栓形成的抑制作用研究［J］.实用中医药杂志，2003，19(11)：563.
       ［2］  池明宇，梅学文，郑贵元，等.绞股蓝丹对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的脑保护作用［J］.中医研究，2003，16(4)：18.
       ［3］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录VIB，7.
       ［4］  田其学，唐正平.绞股蓝口服液中绞股蓝总苷的含量测定［J］.湖南中医杂志，2001， 17 （3）：52.
       ［5］  马筱荷，吴迎辉.绞股蓝袋泡剂工艺条件优选及质量控制［J］.中国中药杂志，1992，17（12）：733.
       ［6］  李  静，何  丽，宋万志.丹参中水溶性酚酸类成分的薄层扫描测定法 ［J］.药学学报，1993， 28（7）∶543.
       ［7］  王文祥，周巧霞，蒋木岗，等.比色法测定丹参及提取物水溶性总酚的改进［J］.中草药，2001， 32（8）∶711.
       ［8］  周和平.葫芦科绞股蓝的皂苷成分与药理［J］.药学通报，1988，23（12）：720.
       ［9］  李新中，雷  鹏 .益脂灵颗粒剂质量标准研究 ［J］.中国现代医学杂志，1996，6（6）：42.
       ［10］  王胜春，蒋永培，迂苏宁 .五灵丸中丹参总酚性成分的测定［J］.第四军医大学，1993，14（5）：386.
       (辽宁省血栓病中西医结合医疗中心中药药理实验室，辽宁 沈阳  110101)