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       【摘要】 
       目的探讨复方玉泉丸保护DNA损伤活性部位及作用机制。方法用不同极性的提取剂热回流序贯提取复方玉泉丸有效成分。在二苯代苦味酰肼自由基（DPPH）和·OH自由基模型上探讨各提取物清除能力，并用CuSO4-Phen-Vit C-H2O2-DNA 化学发光体系测定DNA损伤保护作用。结果各提取部位均能使DPPH自由基体系在517 nm处吸光度明显降低，且在30 min内持续下降。浓度为0.625 mg/ml时，70％乙醇提取物对DPPH的清除率为93.6％，比同浓度下甲醇、丙酮提取物清除能力分别高48.1％和159.3％。无DNA发光反应体系中，乙醇提取物浓度达0.333，0.5，1 mg/ml时，其发光强度分别降低33.8％，54.3％和74.5％。有DNA存在时，70%乙醇、丙酮和甲醇提取部位在浓度为0.625 mg/ml时，对DNA损伤抑制率分别为84.3％，31.5％和51.5％，受损时间分别延长17.4，2.3 min和12.1 min。结论70%乙醇提取物能有效降低DNA损伤程度，并使DNA氧化损伤延迟，其机制与清除DPPH及·OH自由基活性有关。
       【关键词】  复方玉泉丸 DNA损伤 有效部位 化学发光
        糖尿病是一种常见的多病因、有遗传倾向的内分泌代谢紊乱性疾病，其发病率正在逐年增长。经典的糖尿病并发症的多元醇途径、糖基化终末产物途径、蛋白激酶C途径和氨基己糖途径，均是高糖环境下，线粒体呼吸链中氧自由基生成过多导致的结果［1］。由于自由基具有很高的反应活性，它将在分子、细胞乃至器官水平给机体造成损伤，诱导多种并发症［2～5］。因此，在糖尿病、尤其是并发症防治中，重视体内自由基的清除和阻止自由基引起的损伤具有十分重要的意义。
        玉泉丸是我国治疗糖尿病的中药验方，具有生津止渴、清热除烦、养阴滋肾、益气和中之功能，特别是在糖尿病并发症防治方面疗效确切［6～9］。但是，长期以来，对玉泉丸的研究和开发较少，其降血糖作用及具有防治糖尿病并发症的物质基础不清、标准不严、剂型单一。本研究针对糖尿病并发症的危害，以清除DPPH自由基活性及防止·OH自由基引起的DNA损伤为指标，初步筛选玉泉丸药效作用的有效部位，为糖尿病并发症的防治和玉泉丸新剂型的开发提供参考。
       1  器材
       1.1  仪器德国OrionⅡ微孔板发光检测仪；DU600紫外-可见分光光度计；北京长风8002型电热恒温水箱；LDZ5-2低速自动平衡离心机；RE-52AA旋转蒸发仪。
       1.2   材料二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)、抗坏血酸(AsA)、小牛胸腺DNA和邻-菲罗啉(Phen)购自Sigma公司；二丁基羟基甲苯(BHT)购自上海凌峰化学试剂有限公司(化学纯)。硫酸铜、过氧化氢、醋酸、乙醇、甲醇、石油醚、乙醚、丙酮、盐酸均为国产分析纯。复方玉泉丸原料由南京大中华药店购买。
       2  方法
       2.1  玉泉丸制备与提取
       2.1.1  复方玉泉丸的制备取麦冬(60 g)、五味子(30 g)、生地黄(60 g)、葛粉(150 g)、天花粉(150 g)和甘草(25 g)粉，按中药部颁标准（WS3-B-3802-98）进行制备。
       2.1.2  有效部位提取将一定量玉泉丸粉碎，称玉泉丸粗粉末10 g置于圆底烧瓶，按极性由弱到强加100 ml提取液，热回流 (温度根据提取液沸点不同而定)提取30 min，过滤。将滤液在沸水浴中蒸干，称重。滤渣用另一种较高极性的提取液序列提取，如此反复，得不同部位提取物。用乙醇溶解定容至一定浓度作为待测液。所用提取液顺序为：石油醚、乙醚、70%乙醇、丙酮、甲醇和水。另称取两个10g玉泉丸粉末分别用70%乙醇和人工胃液（pH 1.2盐酸水溶液）单独提取。
       2.2  DPPH自由基清除活性称取5.9 mg DPPH自由基，用乙醇溶解后定容到25 ml，此为储备液。应用前稀释10倍，使其浓度为6×10-5mol/L。
        向1 ml 的6×10-5mol/ L DPPH 溶液中加入0.1 ml试样(空白用等量无水乙醇代替)，总体积为1.1 ml 。摇匀后，测定DPPH 混合液在517 nm 处的吸光度（OD）值，每2分钟测定1次，持续测定30 min。用1 ml 乙醇与0.1 ml 试样提取液调仪器零点，以扣除试样本身颜色的影响。取其第30 min时的吸光度计算其清除率：
        清除率(%)=［(A0-A样)/A0］×100%
        其中A样、A0分别为DPPH与样品和无水乙醇在30 min时的吸光度。由于DPPH在光照下吸光度会下降，操作中应注意避光，保证每次DPPH反应液的吸光度基本一致。
       2.3  ·OH自由基清除及DNA损伤保护在1 ml离心管中加入230 μl醋酸缓冲液(pH=5.5)、100 μl待测液(空白用100 μl缓冲液代替)，30 μl硫酸铜(50 000 μmol/L)、200 μl Vit C (28 000 μmol/L)、100 μl Phen (35 000 μmol/L)、140 μl浓度为750 μmol/L DNA (空白用240 μl缓冲液代替)，最后加入200 μl 30%H2O2启动反应。吸取混合溶液200 μl加入微孔板中，测定其发光强度，每2 min测定1次并持续1 h。以其峰高最大值计算抑制率：
        抑制率(%)=(CP0-CP样)/CP0×100%
        其中CP0 、CP样分别为空白和加样品后的发光度最大值。
        本体系除DNA与样品外，所有溶液均用pH=5.5的缓冲液配制，目的是为了保证反应体系的pH为最佳(pH 5.5)。加入H2O2后要尽快测定其发光度值，以防错过最大发光强度时间。
       3  结果
       3.1  玉泉丸不同极性部位与DPPH自由基的反应DPPH·自由基分析法是一种研究天然有机化学成分自由基清除能力，反映抗氧化损伤的简便方法［10］。用6种不同极性的提取溶剂序列提取玉泉丸中的化学成分，然后在DPPH模型中进行反应。结果表明，6种提取部位的成分均能使DPPH自由基在517 nm处的吸光度降低。
        玉泉丸不同极性部位的化学成分与DPPH自由基反应后，其吸光度值随时间变化的动力学曲线不同，同一提取部位在不同浓度下反应曲线也有差异。图1给出了70％乙醇提取部位引起DPPH反应体系吸光度值随时间的变化关系。DPPH与样品反应后，其吸光度明显下降且随浓度的增大反应曲线呈明显的下滑趋势，表明该样品与DPPH反应能力较强，持续时间较久，清除自由基的能力较强，并有一个平衡稳定过程。通过考察每个样品与DPPH的反应曲线可明确其清除DPPH自由基的能力及时间效应关系。
        不同极性部位物质均具有清除DPPH·活性，但清除作用强弱不同（见表1）。与石油醚提取部位相比，相同浓度的乙醚提取物具有更高强度的清除率。在0.625 mg/ml浓度下，70％乙醇提取物清除率（93.6％）最高，比同浓度下甲醇、丙酮提取物清除DPPH能力分别高出48.1％和159.3％。最后的残渣用水提取后，其提取物的自由基清除能力仍然比石油醚和乙醚提取部位强。分析可知，同一种提取物的不同浓度对DPPH自由基清除率也有较大差异。随着提取物浓度的增大，自由基清除率增高。以乙醇提取物为例，浓度为0.312 mg/ml时对DPPH的清除率（83.1％）比浓度0.156 mg/ml时增加70.3％。推测复方玉泉丸中存在的清除DPPH自由基活性的物质可能是中等极性物质，存在于中等极性溶剂提取部位中。
       3.2    玉泉丸不同极性部位对羟基自由基的清除和对DNA损伤的保护作用CuSO4-Phen-Vit C-H2O2-DNA 化学发光体系中，Phen 在金属离子的催化下与H2O2 作用,生成·OH自由基, 产生最大发射在445～450 nm 范围内的化学发光。·OH 自由基引起DNA 损伤，能产生一延迟于Phen 本身氧化发光信号的慢化学发光。最大发光波长范围在380～420 nm，此为鸟嘌呤的特征反应。在有抗氧化剂或自由基清除剂存在时，发光动力学曲线会发生明显变化，表现为发光峰值下降(抑制效应)或发光峰位的后移(延迟效应)。
        图2反映了70%乙醇提取物致无DNA发光体系发生强度和峰值发光时间的变化。在没有加入玉泉丸提取物时，CuSO4-Phen-Vit C-H2O2发光体系在9 min时发光强度达到最大值。在反应体系中加入70％乙醇提取物使其浓度达到0.333 mg/ml，0.5 mg/ml，1 mg/ml时，其发光强度分别降低了33.8％，54.3％和74.5％，发光峰值出现时间分别延长了2，6 min和19 min。该提取物能大幅度降低·OH反应体系的发光强度，并随着浓度的升高，对体系·OH发光效应淬灭的强度越大。说明复方玉泉丸70%乙醇提取物部位具有显著地清除该发光体系中产生的·OH自由基能力，并呈现一定的浓度相关性。
       
        在有DNA存在的CuSO4-Phen-Vit C-H2O2-DNA 反应体系中，不同部位的玉泉丸提取物测试液抑制DNA损伤的效果见表1。同DPPH清除能力相似，10 mg/ml石油醚和乙醚提取部位对DNA损伤的抑制率较低。70%乙醇、丙酮和甲醇提取部位对DNA损伤的抑制率较高。当浓度达0.625 mg/ml时，乙醇提取物对DNA损伤的抑制率为84.3％，并使DNA受损时间延迟了17.4 min。综合分析表1可知，6种提取部位均有一定的抑制DNA损伤、并延缓受损时间的作用，但其强度因不同的提取部位和作用浓度而不同。相比较而言，作为抗氧化剂，70%乙醇提取物的作用强于其它提取物。表1  不同部位样品清除自由基能力和抑制DNA损伤效果（略）
       
       4  结论
        复方玉泉丸提取物对自由基导致的DNA损伤有保护作用，是天然的抗氧化剂和自由基清除剂，能有效清除DPPH自由基和羟基自由基，抑制自由基对DNA的损伤，并延缓其受损时间。其中70%乙醇提取物的清除能力明显高于其它几种提取物。相对于其它提取溶剂而言，乙醇对人体毒害较小，且提取制备程序相对简单，成本低。因此，乙醇提取物具有良好的开发和应用价值。至于各种提取部位在清除活性氧和抗氧化作用中的贡献和机理有待进一步实验分析。本研究从自由基生物学角度为复方玉泉丸在食品、医药和保健食品等开发利用方面提供了重要依据。
       【参考文献】
         　　［1］Tania Bose, Abhay Sankar Chakraborti. Fructose-induced structural and functional modifications of hemoglobin: Implication for oxidative stress in diabetes mellitus［J］. Biochimica et Biophysica Acta, 2008, 1780: 800.
       
       ［2］郑荣梁, 黄中洋. 自由基生物学［M］. 北京: 高等教育出版社, 2007：6.
       
       ［3］王雪艳，匡洪宇. 糖尿病与糖尿病肾病患者氧化应激状态的分析［J］. 齐齐哈尔医学院学报，2008，29(6)：694.
       
       ［4］Kelvin J.A. Davies. The evolution of Free Radical Biology & Medicine: A 20-year history ［J］. Free Radical Biology & Medicine, 2005, 39: 1263.
       
       ［5］Marian Valko, DieterLeibfritz, Jan Moncol, et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease ［J］. The International Journal of Biochemistry&CellBiology, 2007, 39: 44.
       
       ［6］郑 勇，黄达勤. 玉泉丸对早期糖尿病肾病肾损害指标的影响［J］.现代中药研究与实践，2005，19（2）：42.
       
       ［7］邓银泉，范小芬，吴国琳，等. 玉泉丸对2型糖尿病促炎细胞因子干预的影响［J］. 中国中西医结合杂志，2006，26（8）：706.
       
       ［8］彭 聪，郑承红. 玉泉丸对2型糖尿病患者胰岛素敏感性影响的临床研究［J］. 湖北中医杂志，2008，30（3）：11.
       
       ［9］张 勤，林 垦，吴 桐，等. 玉泉丸治疗2型糖尿病胰岛素抵抗疗效观察［J］. 实用医院临床杂志，2007，4（5）：80.
       
       ［10］柳 艳，李 磊，赵鸿雁. 丹酚酸B清除DPPH有机自由基活性及影响因素研究［J］. 时珍国医国药，2006，17（12）：2406.