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       【摘要】 
       目的将现代酶解技术应用于板桥党参多糖的提取，筛选出最佳提取工艺。方法以板党多糖得率为指标，先考察木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶各自最适当的酶用量、酶解时间、酶解pH及酶解温度，再通过正交实验和方差分析确定复合酶法提取板党多糖的最佳条件。结果在木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的酶用量分别为90，90，150 U/g干粉复合下，pH5.0、50℃酶解90 min，板党多糖得率最高，达26.47%。结论采用酶解辅助提取板党多糖，可以明显提高多糖的提取率。
       【关键词】  板党 多糖 复合酶
        党参Radix Codonopsis是我国传统常用中草药，为中药“八参”之首，具有补中益气、和胃养血等功效，其中党参多糖作为主要的药物活性成分，一直是党参品质鉴定的主要指标，其能提高小鼠脑SOD活性，降低MDA含量，有助于清除体内自由基，且能提高机体的免疫能力，可以抗衰老［1～3］。本研究以板桥党参（简称“板党”）为原料，利用酶法技术提取板党多糖，以提高多糖的得率，提高产品的科技含量及附加值，为进一步开展其药用及保健方面的开发应用奠定基础。
       1  材料与仪器
       1.1  材料板桥党参，由恩施市峰岚板桥党参有限公司提供，实验室纯化。
       1.2  仪器与试剂TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；pHSJ-4A型实验室pH计（上海精密科学仪器有限公司）；HWS12型电热恒温水浴锅（上海—恒科技有限公司）；S21-3磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）；DL6MB型大容量冷冻离心机（长沙科威实业有限公司）。
       木瓜蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司，酶活6000U/mg）；纤维素酶（国药集团化学试剂有限公司，酶活15000U/g）；精制果胶酶（天津市利华酶制剂厂，酶活20000U/g）；所用其他化学试剂均为国产分析纯。
       2  方法
        流程：
        粉粹板桥党参，过40目筛，60℃干燥2 h。称取100 g置500 ml圆底烧瓶，加石油醚250 ml，77℃回流1 h脱脂，过滤，石油醚回收，滤渣挥干溶媒，加250 ml 80%乙醇浸渍过夜。
        86℃回流提取2次，1.5 h/次，过滤，滤渣挥干溶媒。
        准确称取0.2 g处理样品，加蒸馏水100 ml，调pH，升温，加入酶，不同条件下酶解，离心，滤液加95%乙醇使醇含量达80%，冰箱静置过夜。
        适量水溶解，加入3倍体积Seveage试剂，振荡，静置，分液，再进行两三次振荡分离后醇析过夜。
        定容，硫酸苯酚法［4］测定多糖含量，计算提取率。
       3  结果
       3.1  单酶酶解条件的确定
       3.1.1  最适酶用量的确定准确称取0.2 g样品6份，分别放入具塞三角瓶中，加蒸馏水100 ml，调pH6.0，依次分别加入酶用量0，30，60，90，120，150 U/g干粉，50℃恒温水浴浸提120 min后迅速升温至90℃灭酶10 min，流动水冷却至室温，离心，醇析，除蛋白，测多糖含量，计算多糖得率。结果见图1。
       
        由图1可见，添加木瓜蛋白酶、纤维素酶及果胶酶在一定程度上均可提高板党多糖的得率。对于木瓜蛋白酶和纤维素酶，其添加量在30～90 U/g干粉范围，随着酶添加量的增加，多糖的得率呈上升趋势，当酶添加量大于90 U/g干粉后，多糖的得率不再增加，反而有下降的趋势；而果胶酶的添加量在120 U/g干粉时方使多糖得率达最高，因此，确定木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶各自的最适加酶量分别为90，90和120 U/g干粉。
       3.1.2  最适酶解时间的确定准确称取0.2 g样品7份，分别放入具塞三角瓶中，加蒸馏水100 ml，调pH6.0，酶用量木瓜蛋白酶和纤维素酶均为90 U/g干粉，果胶酶120 U/g，干粉50℃恒温水浴分别浸提0，30，60，90，120，150，180 min后迅速升温至90℃灭酶10 min，流动水冷却至室温，离心，醇析，除蛋白，测多糖含量，计算多糖得率。结果见图2。
       
        从图2可知，随着提取时间的延长，板党多糖得率呈上升趋势，但总提取时间在木瓜蛋白酶达150 min，纤维素酶达120 min，果胶酶达60 min后，多糖得率随时间增长而下降。一方面，随着酶解时间的延长，板党细胞壁及细胞间层的纤维素阻挡层已被有效破解，糖类物质大多已从细胞内扩散到溶液中，细胞内外的多糖浓度已达到了一种动态平衡；另一方面，酶促反应的产物，如纤维二糖、葡萄糖、半乳糖醛酸等在溶液中浓度的积累会对酶促反应造成抑制。
       3.1.3  最适酶解pH的确定准确称取0.2 g样品7份，分别放入具塞三角瓶中，加蒸馏水100 ml，依次调pH3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，酶用量木瓜蛋白酶和纤维素酶均为90 U/g干粉，果胶酶120 U/g，干粉50℃恒温水浴木瓜蛋白酶浸提90 min，纤维素酶浸提120 min，果胶酶浸提60 min后迅速升温至90℃灭酶10 min，流动水冷却至室温，离心，醇析，除蛋白，测多糖含量，计算多糖得率。结果见图3。
       
        图3的曲线反映了pH值对板党多糖得率的影响规律。每种酶都有最适pH值，在此pH值下催化反应的速率最高。过酸或过碱的条件下，酶的空间结构会受到破坏，影响其与底物的结合，从而使多糖得率下降。对本实验所用的木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶，最适酶解pH值分别为5. 0，4.0和5.0。
       3.1.4  最适酶解温度的确定准确称取0.2 g样品2份，分别放入具塞三角瓶中，加蒸馏水100 ml，木瓜蛋白酶调pH6.0、纤维素酶调pH4.0、果胶酶调pH 5.0，酶用量木瓜蛋白酶和纤维素酶均为90 U/g干粉，果胶酶120 U/g，干粉依次于35，40，45，50，55℃恒温水浴木瓜蛋白酶浸提90 min、纤维素酶浸提120 min、果胶酶浸提60 min后迅速升温至90℃灭酶10 min，流动水冷却至室温，离心，醇析，除蛋白，测多糖含量，计算多糖得率。结果见图4。
       
        由图4可见，木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的最适酶解温度分别为40，45和55℃，木瓜蛋白酶和果胶酶的曲线变化趋势较平缓，而纤维素酶的波动则较大，在45℃之前，随着温度的升高，多糖得率迅速上升；45℃后随着温度的提高呈现下降趋势。温度升高，反应速度加快，多糖得率增加，而酶本生是一种蛋白质，温度过高会使其变性失去活性，致使多糖得率随之下降。
       3.2  复合酶解条件的确定在单因素酶解实验的基础上，为了进一步优化酶解参数，选用L8（27）正交表进行正交实验，实验结果及方差分析见表1～2。表1  复合酶解正交实验结果及极差分析（略）表2  正交实验方差分析（略）
       
       由表1极差分析可知，影响复合酶法提取板党多糖得率的各因素主次关系为：A（木瓜蛋白酶用量）>E（酶解温度）>F（酶解时间）>G（酶解pH）>C（果胶酶用量）>B（纤维素酶用量）>D（空列）。表2方差分析结果表明，木瓜蛋白酶用量、酶解温度和酶解时间对多糖提取率影响存在着极显著差异（P<0.01），果胶酶用量和酶解pH的影响存在着显著差异（P<0.05），而纤维素酶用量的影响则不显著，与极差分析结果一致。另外，由极差分析结果得知，木瓜蛋白酶和纤维素酶用量及酶解时间均以第1水平为最佳，而果胶酶用量、酶解温度及酶解pH则以第2水平为佳，即复合酶法提取板党多糖的最优工艺参数应为：A1B1C2E2F1G2。由于正交实验并不包含各种组合，具有信息丢失现象，因此对该组合进行验证实验，结果表明，多糖得率为26.47%，高于其它组合，故在本实验中确定复合酶法提取板党多糖的最优工艺参数为：木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶酶用量分别为90，90和150 U/g干粉，酶解温度50℃，酶解时间90 min，酶解pH 5.0。
       4  结论
        传统提取多糖的工艺复杂，产品得率低，且产品纯度不高，将酶法技术应用于天然药物和中药的提取制备中，不仅操作简便，成本低廉，而且可以提高有效成分的提取率和纯度。在实验中，由单因素及正交实验所确定的复合酶法提取板党多糖的最优工艺参数为木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶酶用量分别为90，90，和150U/g干粉，酶解温度50℃，酶解时间90 min，酶解pH5.0，此条件下的多糖得率为26.47%。
       【参考文献】
         　　［1］陈 兢, 王拮之. 党参多糖的研究进展［J］. 现代生物医学进展, 2007, 7(4): 54.
       
       ［2］Grubeck LB. Changes in the aging Immune system［J］. Biologicals, 1997, 25: 205.
       
       ［3］Telford WG, Moller RA. Aging increases CTcell apoptosis induced by hyperstimulation but decreases apoptosis induced by agonist with drawal in mice［J］. Cell Immunol, 1999, 191: 131.
       
       ［4］张惟杰. 糖复合物生化研究技术［M］. 杭州: 浙江大学出版社, 1994：11.