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       【摘要】 
       目的采用高效液相色谱（HPLC）法测定昆明石杉中石杉碱甲的含量。方法采用ZORBAX SB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：0.02mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈（92∶8），检测波长：310 nm。结果石杉碱甲在0.015～0.048 μg之间与峰面积呈良好线性关系（r=0.999 95），平均回收率为99.63%，RSD为0.56%。结论首次对昆明石杉中石杉碱甲的含量进行测定，该方法易行、灵敏、准确。
       【关键词】  昆明石杉 石杉碱甲 高效液相色谱
        昆明石杉Huperzia kunmingensis Ching.系石杉科石杉属植物，为我国特有种，主要分布于云南、贵州等地，生于灌木下、苔藓丛中［1］。20世纪80年代，我国科学工作者从同属植物蛇足石杉中分离到石杉碱甲(Hup-A)，并阐明它是一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂，对治疗重症肌无力、记忆力减退和早老年痴呆具有较好的效果［2，3］，现已被广泛应用于临床。为了科学、合理地利用石杉属植物资源，本实验首次采用HPLC法对昆明石杉中石杉碱甲的含量进行测定，为寻找和筛选石杉碱甲新的植物资源提供科学依据。
       1    仪器与试药
         Aigent 1100型HPLC色谱仪(带四元泵，自动进样器，紫外检测器等)；电子分析天平（日本岛津）；KQ50B超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（上海医疗器械厂）；石杉碱甲对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100243-200401）；乙腈（色谱纯）；二次重蒸水；其他试剂均为分析纯。
        实验药材采至贵州黔东南，由贵州科学院生物研究所王培善教授鉴定为昆明石杉H． kunmingensis Ching.，标本存放于贵阳中医学院民族医药研究所，标本凭证（20056）。
       2    方法与结果
       2.1   色谱条件ZORBAX SB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相0.02 mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈（92∶8），检测波长为310 nm，流速1 ml·min-1，柱温25℃，进样量为5μl。在此色谱条件下，样品中的石杉碱甲与其他峰能达到基线分离，其理论塔板数为4 656，对称因子为0.92。石杉碱甲的保留时间为11.15 min，对照品与样品的色谱图见图1。
       
       2.2   样品的制备 
       精密称取实验药材细粉2 g于500 ml的圆底烧瓶中，每次加入200 ml石油醚提取3次，弃去滤液。滤渣再用95%的甲醇提取3次，合并滤液并回收溶剂，加入2%的酒石酸溶解，用氨水调节pH值至8.0，再用氯仿萃取至Dragendorffor" s反应呈阴性，挥干有机溶剂，用无水乙醇溶解并定容至25ml即得。
       2.3   线性关系的考察 
       精密称取石杉碱甲对照品2.40 mg于25 ml容量瓶中以无水乙醇溶解并定容，得浓度为0.096 mg·ml-1对照品溶液，再分别稀释成0.096，0.048，0.024，0.012，0.006，0.003 mg·ml-1的对照品供试液，在色谱条件下测定。以进样浓度对峰面积进行回归，得方程：Y=6 776.015 1X + 1.030 5，r=0.999 95。可知石杉碱甲在0.015～0.48 μg之间与峰面积呈良好线性关系。
       2.4  精密度实验 取石杉碱甲对照溶液，在色谱条件下重复进样6次，结果石杉碱甲峰面积的RSD为0.36%（n=6）。
       2.5  稳定性实验取供试品溶液，每隔2 h测定1次，考察石杉碱甲的含量变化，结果含量的RSD为0.85%（n=6），表明供试品在10 h内稳定。
       2.6   重复性实验精密称样品6份，按“2.2”项的要求制备6份供试液，在色谱条件下分别进行测定，结果Hup-A含量的RSD为0.60%（n=6）。
       2.7   回收率实验精密称取昆明石杉药材细粉6份，每份1 g，分别加入对照品供试液（0.003 mg·ml-1）100 ml，按样品制备方法和色谱条件，制备加样回收供试液进行测定，计算回收率（见表1）。结果石杉碱甲的平均回收率为99.63%，RSD=0.56%（n=6）。表1  石杉碱甲加样回收率实验结果（略）
       
       2.8  样品的测定 
       按“2.2”项的要求精密称取样品3份，制备供试液，按色谱条件进行测定，重复3次，取平均值，石杉碱甲在原植物中的平均含量为0.03%。
       3  讨论
        首次采用HPLC法测定昆明石杉中石杉碱甲的含量。
        测定方法是在其它石杉中石杉碱甲含量测定［4，5］方法的基础上，改用ZORBAX SB-C18色谱柱及以0.02 mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈（92∶8）为流动相。实验证明该方法易行、灵敏、准确、可靠。
        在同科属植物中，昆明石杉是石杉碱甲含量相对较高的一个植物品种，达到0.03%。
       【参考文献】
         　　［1］王培善，王筱英．贵州蕨类植物志［M］．贵阳：贵州科技出版社，2001：12．
       
       ［2］Liu J S，Zhu Y L．The structure of Hup A and B，tow new alkaloids exhibiting marked anticholinesterase activity［J］．Can J Chen，1986，64：837．
       
       ［3］唐希灿．石杉碱甲——一种有望治疗早老年痴呆症的药物［J］．中国药理学报，1996，17（6）：481．
       
       ［4］孙远明，余红英，杨跃生．HPLC法测定蛇足石杉中石杉碱甲含量［J］．中草药，2002，12（33）：1079．
       
       ［5］刘建廷，黎 艳，严 伟．石杉碱甲提取工艺研究［J］．天然产物研究与开发，2006，18（2）：298．