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       【摘要】 
       目的研制注射用葛根素纳米乳。方法采用单因素筛选，通过相图优化制备工艺，并对葛根素纳米乳的理化性质、形态和粒径分布、含量等质量指标进行考察。结果最适宜的油相、表面活性剂和助表面活性剂分别为大豆油、磷脂和山梨醇，三者之间的最适比例为1.6∶20∶20。以优化处方和工艺制备的注射用葛根素纳米乳的含量为2.5％，外观呈浅黄色，透明，乳滴呈球形，平均粒径为32.4 nm，粒径分布较窄，电导率为69 μs·cm-1，粘度为17.8 mPa·s，折光率为1.3815，稳定性较好。结论成功地研制了具有较好质量指标的葛根素纳米乳，为注射用葛根素纳米乳进一步研究奠定了良好的基础。
       【关键词】  葛根素 纳米乳 伪三元相图 质量评价
       Preparation and Evaluation of Puerarin Nanoemulsion for Injection
       LI Jun，  REN Fen， JIANG Birong
       （Key Laboratory of Tropic Biological Resourcs (Hainan Univesity), Ministry of Education, Hainan Haikou, 570228, China;   College of Oceanology,Hainan University, Hainan Haikou 570228, China; 3. College of Civil Enginerening and Architecture Hainan University , Hainan Haikou 570228, China）
       Abstract：ObjectiveTo study nanoemulsion of puerarin for injection. MethodsSingle factor screening and phase diagram were used to optimize preparation process, and physicochemical properties, shape, size, size distribution and content of puerarin nanoemulsions were invesegated.ResultsOptimum oil, surfactant and cosurfactant were soybean oil, phospholipase and sorbitol with their optimum proprotion of 1.6∶20∶20. The puerarin emulsion for injection had 2.5% puerarin, and appeared yellow, transparent. Droplets in emulsions showed spherical with average size 32.4 nm, conductivity 69 μs·cm-1 , viscosity 17.8 mPa·s, refractive index 1.3815 and good stagility.ConclusionPuerarin nanoemulsions were developed successfully.
       Key words：Puerarin;    Nanoemulsion;   Pseudo-ternary phase diagram;   Quality evaluation
        葛根素是于20世纪90年代中期上市的国家中药一类新药，对心脑血管疾病具有确切的疗效，但其水溶性差、口服难吸收、血浆半衰期短、生物利用度低，加之近年来对葛根素注射液临床应用的不良反应亦有较多报道［1］，这些不足限制了葛根素的临床应用［2，3］。纳米乳是近年来发展起来的一种新型给药系统，能够增加难溶性药物的溶解度、促进药物经胃肠道吸收或透皮吸收、延长药物释放时间、减轻注射疼痛和其他不良反应，是一种极具发展潜力的新型给药系统。鉴于此，本文以纳米乳为给药载体，以葛根素为模型药物，研制注射用葛根素纳米乳，以提高葛根素的临床疗效，降低毒副作用。
       1  药品与仪器
        注射用葛根素，四川巨邦植物药有限公司产品；注射用豆磷脂 上海太伟产品；花生油、大豆油，市售，经精制；其它试剂均为国产分析纯。
        UV-2450 紫外-可见分光光度计，岛津（日本）产品；DV-1数字式粘度计，上海伦捷机电仪表有限公司产品；DDS-11A型数字式电导率仪，上海伟业仪器厂产品；纳米型激光粒度仪A 22 Nano Tec  Fritsch（德国）； 2W阿贝折光仪，上海光学仪器厂产品。
       2  方法与结果
       2.1   葛根素在不同油相中的溶解度将过量的葛根素原料药分别置于2 g的花生油、大豆油、液状石蜡中，涡旋混匀0.5 h，37℃振荡24 h，以达平衡，再以4 000 r·min-1离心，取上清液适量，测得葛根素的溶解度依次为（1.6±0.01），（3.6±0.01），（0.03±0.01）mg·g-1。由实验结果可知，葛根素在大豆油中的溶解度最大，故可以考虑选择大豆油作为制作葛根素纳米乳的油相。
       2.2  表面活性剂的筛选葛根素在大豆油中的溶解度最大，但仅靠油相溶解不能满足临床给药剂量，所以必须选择对葛根素增溶能力强的表面活性剂。BachynskyM.O等研究表明，形成ME的最佳HLB值在11～15之间，浓度适中，形成的粒径较小。本文选用了药剂学上常用的3种非离子表面活性剂泊洛沙姆188、乳化剂OP和磷脂。测定方法为：分别将过量的葛根素原料药置于泊洛沙姆188、乳化剂OP、磷脂的胶束水溶液中，涡旋混匀，37℃振荡24 h，以达平衡。以4 000 r·min-1离心20 min，取上清液适量，测得葛根素的溶解度依次为（110.00±0.12），（180.00±0.21），（213.00±0.17）mg·g-1。由实验结果可知，葛根素在磷脂中的溶解度最大，故选取磷脂作为研制葛根素纳米乳的表面活性剂。
       2.3  油相和助表面活性剂的筛选将磷脂分别与助表面活性剂无水乙醇、1,2-丙二醇、PEG400﹑山梨醇按重量比Km=1∶1配成相同浓度的胶束溶液10 ml，磷脂与助表面活性剂浓度各为0.25 g·ml-1，均分3份，每份胶束溶液分别滴入油相花生油、大豆油、液状石蜡中形成体系，涡旋，以澄清度为指标，观察各体系的变化。结果表明，只有以大豆油为油相的体系能形成透明纳米乳。室温放置后，无水乙醇-水体系变浊，其余种体系仍澄清透明。
        分别以1,2-丙二醇、PEG400、山梨醇为助表面活性剂，磷脂为表面活性剂，大豆油为油相，Km=1∶1，绘制伪三元相图，进一步比较各体系形成纳米乳区域面积。实验结果表明，含山梨醇体系的纳米乳区域面积最大。纳米乳区域的大小和纳米乳的稳定性有很大的关系，纳米乳区域面积大说明该体系形成的纳米乳最稳定，山梨醇的助乳化能力最强，故选取山梨醇为助表面活性剂，大豆油为油相。
        经过以上一系列试验的筛选，空白纳米乳的处方可以确定为：表面活性剂——磷脂，助表面活性剂——山梨醇，油相——大豆油。
       2.4  空白纳米乳伪三元相图的绘制以大豆油为油相，磷脂为表面活性剂，山梨醇为助表面活性剂，参照文献［4］绘制伪三元相图，确定纳米乳区的范围，找出各组分的最佳比例。
        将磷脂和山梨醇按质量比Km=1∶1，1∶2，2∶1混匀后，再按磷脂与油酸乙醋的质量比为1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5的不同比例混合。先让其磁力搅拌均匀，再边搅拌边用水滴定，以澄清度为指标，判断是否形成纳米乳，记录形成纳米乳时临界点各组分的质量百分含量。在相图中找出相应的点，把能形成纳米乳的各点以曲线相连绘制成伪三元相图。结果见图1～3。
        图中每一条边表示相应两组分的比例关系，任一点表示各组分的质量百分含量。在滴定过程中，开始会出现粘度较大的状态，甚至形成凝胶搅拌困难，但当水滴加到某一点时，体系的粘度突然变小似水，流动性极好形成澄清、透明的纳米乳，此时可以作为形成纳米乳的临界点。本实验绘制的三元相图中只标出了纳米乳区，纳米乳区的大小和纳米乳的稳定性有很大关系，纳米乳区越大说明纳米乳越稳定，越不易受其它因素的干扰。
        由空白纳米乳三元相图可知当Km=1∶1时，纳米乳的区域最大，即最稳定。所以选用Km=1∶1作为处方中表面活性剂与助表面活性剂的重量比，选取该比例进行空白纳米乳的制备。从Km=1∶1的三元相图上进行处方的优化，以选择各成分的用量比例关系。从图上可以看出纳米乳的最大载油量约为3.2﹪，混合表面活性剂的用量约为75﹪。越接近纳米乳区域边缘体系越不稳定，综合考虑纳米乳的稳定性及表面活性剂的用量用量过大可能会对人体胃肠粘膜造成一定的伤害，用量过少对油的乳化能力弱，以至于不能形成稳定的纳米乳，取油相和混合表面活性剂最大用量的50﹪来制备纳米乳，即油相用量占1.6﹪，混合表面活性剂的用量占40﹪，也就是磷脂∶山梨醇∶大豆油∶水的重量比20∶20∶1.6∶58.4. 此时形成的纳米乳体系较稳定，表面活性剂的用量适中，纳米乳的流动性极好。
       
       2.6  葛根素含量测定标准曲线的绘制和回归方程的建立
       2.6.1  吸收波长的选择精密称取葛根素适量，用超纯水溶解并稀释至适当浓度，于200～600 nm波长进行扫描，并以空白纳米乳为对照。结果表明，葛根素在和250 nm和305 nm处有两个吸收峰，空白纳米乳在250 nm处吸收较强，对测定结果干扰较大，在波长305 nm处几乎无吸收，不干扰测定。故选择305 nm为测定波长。
       2.6.2  葛根素标准曲线的绘制及回归方程的建立精密称取葛根素0.100 0 g，用超纯水溶解并稀释定容至500 ml，制得200 μg·ml-1的葛根素储备液。取适量该储备液，配置一系列适当浓度的葛根素溶液，在305 nm处对不同浓度的葛根素溶液进行吸光度的测定。结果如图4所示，表明葛根素在0～30 μg·ml-1的浓度范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系。
       
       2.7  葛根素纳米乳类型鉴别采用离心法［5］、染色法［6］鉴别纳米乳。离心法是以6 000 r·min-1离心30 min，观察是否分层，颜色、澄清度是否改变，若经过离心不分层，颜色、澄清度都无变化可判断为纳米乳。取葛根素纳米乳成品进行上述实验，证实制备的样品为纳米乳。
        判断葛根素纳米乳的类型：利用油溶性染料苏丹红（红色）和水溶性染料亚甲兰（蓝色）在纳米乳中扩散的快慢来判断纳米乳的类型，若红色扩散快于蓝色则为W/O型纳米乳,反之则为O/W型纳米乳。结果表明，本实验所制得的葛根素纳米乳为O/W型纳米乳。
       2.8  饱和葛根素纳米乳液的制备将过量的葛根素加入到由磷脂、山梨醇、大豆油按处方比例组成的混合液中，涡旋混匀，加入处方量的水，磁力搅拌混匀，于37℃搅拌24 h，然后再以6 000 r·min-1离心40 min，取上清液，即得到葛根素纳米乳饱和液体。
        将上述饱和液用超纯水稀释成适当浓度，于305 nm处测吸收度并计算浓度。按上述方法实际测得饱和葛根素纳米乳液的含量分别为（S1=25.50 mg·ml-1，S2=25.44 mg·ml-1，S3=25.50 mg·ml-1）取平均值为25.48 mg·ml-1，即葛根素在纳米乳中的溶解度为25.48 mg·ml-1。
        据文献［7］报道葛根素在水中的溶解度约为0.011 mol·L-1，显然低于本实验制得的纳米乳中葛根素的含量。
       2.9  葛根素纳米乳质量评价
       2.9.1  外观性状制得的葛根素纳米乳液为澄清、透明的浅黄色、流动性极好的液体。
       2.9.2  理化性质电导率可以用来判断纳米乳的类型，电导率较大的为O/W型纳米乳，电导率较小的为W/O型纳米乳；粘度和折光率可以用来检查纳米乳的纯度；纳米乳的流变性对纳米乳的制备和使用具有重要意义，注射剂必须通针性好，对机体刺激性小，不引起疼痛，故要求体系粘度较低。研究表明，葛根素纳米乳中油量增加，则纳米乳的粘度增加，但均能自由流动，并具有良好的通针性。
        取注射用葛根素纳米乳样品适量，用数字式粘度计测定粘度，用电导率仪测定电导率，用阿贝折光仪测定折光率。测定结果见表1。表1  葛根素纳米乳的理化性质（略）
       
       2.9.3  形态和粒径分布采用透射电镜研究纳米乳形态。取适量葛根素纳米乳滴在铜网上，用磷钨酸溶液负染后晾干，于透射电镜下观察。结果见图5。从图5可以看出，葛根素纳米乳乳滴呈球形，大小均匀。
        纳米乳粒径和粒径分布采用激光散射粒度测径仪测定。结果表明，葛根素纳米乳平均粒径为32.4nm，92.5％的乳滴粒径在15.45～43.56 nm之间，说明制备的注射用葛根素纳米乳粒径分布较窄，粒径较均匀。
       
       2.9.4   稳定性
        离心稳定性：将制备的葛根素纳米乳以6 000 r·min-1离心40 min，观察有无分层、沉淀或浑浊等现象。结果表明葛根素纳米乳未出现分层、沉淀或浑浊等异常现象。
        配伍稳定性：用葡萄糖注射液或氯化钠注射液将葛根素纳米乳稀释50倍，纳米乳外观仍澄清透明。    长期稳定性：将本实验制得的葛根素纳注乳灌封于安瓿瓶中，分别置于4，25，37，60℃的条件下进行稳定性考察，于0，10，30，60，90，180 d分别取样进行性状观察、粒径测定和含量分析。结果表明，葛根素纳米乳在上述条件下，色泽、透明度、粒径和含量未有显著变化，说明葛根素纳米乳受温度影响较小，性质比较稳定。
       3  讨论
        通过筛选合适的注射用油、乳化剂和助乳化剂，并通过伪三元相图寻找最佳的纳米乳处方和工艺，成功地制备了葛根素注射用纳米乳，证实了纳米乳能够显著增加在水和油中均难溶的药物葛根素的溶解度，葛根素在纳米乳中的溶解度是其在水中溶解度的6倍。国外报道的油、水均难溶的喜树碱在纳米乳中的溶解度是水溶液的23倍［8］。溶解度增大，有助于提高难溶性药物的生物利用度。
       纳米乳制备过程中往往须加入较高浓度的表面活性剂，以降低液滴表面张力，得到粒径较小的乳滴。大量表面活性剂可能对机体产生不良反应［9］。本研究选用的表面活性剂为注射用豆磷脂，其毒性、刺激性和溶血性均较小，适合作为注射用乳剂的乳化剂。通过处方和工艺优化，有效地降低了乳化剂的用量。
        本实验对制备的葛根素纳米乳的质量进行了较为详尽的评价，除了测定葛根素的含量外，还对纳米乳的粘度、电导率、折光率、粒径和粒径分布等理化性质作了测定，对稳定性亦作了考察。注射用葛根素纳米乳能否有效地降低或消除常规葛根素注射液临床应用时的不良反应，提高葛根素的疗效，尚需作进一步深入研究。
       【参考文献】
         　　［1］丁国华. 葛根素注射液的不良反应［J］. 时珍国医国药，2001，12（5）：476.
       
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       ［3］胡 静，徐德生.葛根素药理和临床研究进展［J］. 世界临床药学，2006，27（4）：215.
       
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