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       【摘要】 
       目的探讨山茱萸几种提取部位对D-半乳糖致衰模型小鼠骨髓细胞DNA的影响。方法取ICR小鼠，复制D-半乳糖致衰模型，给小鼠灌服药液，通过单细胞电泳和流式细胞仪检测，观察D-半乳糖致衰模型小鼠骨髓细胞DNA的变化及山茱萸几种提取部位的保护作用。　结果D-半乳糖对小鼠骨髓细胞脱氧核糖核酸(DNA)结构表现出一定的的影响，山茱萸几种提取部位尤其是石油醚萃取部位表现出保护作用。结论山茱萸提取部位对D-半乳糖致衰模型小鼠DNA结构有不同程度的影响。
       【关键词】  山茱萸;提取部位;D-半乳糖;脱氧核糖核酸
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of extracts from Fructus Corni on DNA of marrow cells in D-galactose induced subacute aging mice.　MethodsThe subacute aging model was established by D-galactose induced in ICR mice, and the DNA change was tested by single-cell electrophoresis and flow cytometry detection.ResultsD-galactose had the effect on DNA of marrow cells of ICR mice and extracts from Fructus Corni, especially the extract of petroleum showed certain protective effects against DNA damage.ConclusionThe extracts from Fructus Corni have effect on DNA of marrow cells in D-galactose-induced subacute aging mice.
       Key words：Fructus Corni; Extract; D-galactose; DNA
       山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc 的干燥成熟果肉，其味酸、涩，微温，归肝、肾经。临床上多用山萸肉、酒山萸肉。山萸肉长于敛汗固脱，用于自汗或大汗不止，阴虚盗汗;经酒蒸制后，补益肝肾作用增强，多入滋补方剂，临床用于内热消渴,眩晕耳鸣,腰膝酸痛,阳痿遗精,尿遗尿频,崩漏带下,大汗虚脱等[1，2]。现代研究表明山茱萸具有多种药理作用[3]。课题组前期研究表明，山茱萸制品几种提取部位对自然衰老小鼠大脑、卵巢有一定的影响，对骨髓细胞DNA等也表现出一定的保护作用[4~6]。本研究依据前期实验，选择最佳剂量，复制小鼠D-半乳糖化学致衰模型，通过单细胞电泳和流式细胞仪检测，对骨髓细胞DNA进一步观察。实验如下。
       1 材料与仪器
       1.1 药物山茱萸药材，购于河南西峡县山茱萸医药公司，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为山茱萸的干燥成熟果肉。
       1.2 动物ICR小鼠，体质量18～22 g，由南京中医药大学实验动物中心提供。
       1.3 试剂正常熔点琼脂糖(NMPA)，华美生物工程公司产品;低熔点琼脂糖(LMPA)，Sigma公司产品，进口分装; TritonX-100，Amresco公司产品，进口分装;溴化乙锭(EB)，Sigma公司产品，进口分装;PI染料，PE公司提供。
       1.4 仪器BX50/BX-FLA型荧光显微镜，日本OLYMPUS公司出品;DYCP-38A水平电泳槽，北京六一仪器厂产品;DYY-6B型稳压稳流电泳仪 ，北京六一仪器厂产品;流式细胞仪，FACSCalibur,美国产品。
       2方法
       2.1 山茱萸制品几种提取部位的制备山茱萸饮片由南京中药饮片厂按2005版《中国药典》[1]加工制得山茱萸酒蒸品。取一定量的山茱萸酒蒸品，用10倍量95%乙醇回流提取1.5 h，趁热抽滤，药渣加10倍量50%乙醇回流提取1.5 h，趁热抽滤，药渣加10倍量蒸馏水回流提取1.5 h，趁热抽滤，合并滤液，60℃旋转蒸发浓缩制成浸膏，依次用石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇萃取，挥干溶剂即得相应的溶剂萃取物，其中石油醚、正丁醇溶剂萃取部位用吐温-80∶植物油∶水=1∶1∶8配成乳剂在本实验中备用。取一定量的山茱萸酒蒸品粗粉(20目，去核)，加蒸馏水提取1.5 h，抽滤，滤液加无水乙醇至醇浓度为80%(V∕V)，醇沉，过夜，抽滤，然后收集醇沉粗多糖部位，于50℃真空干燥至恒重，精密称定多糖的重量,用蒸馏水配成一定浓度的溶液备用。
       2.2亚急性衰老模型的制备取ICR纯种小鼠，每天颈背部皮下注射5% D-半乳糖溶液0.1 ml/10 g(即500 mg/kg)造模，连续注射1个月，1个月后进行指标检测。
       2.3 分组与给药ICR小鼠(18～22g)随机分为5组，分别为正常对照组，模型组，用药组。均行灌胃给药,1次/d,连续30 d，给药剂量根据前期实验结果选择、确定结果表1。表1实验分组情况
       2.4动物取材 颈椎脱臼处死小鼠，取股骨，用生理盐水冲出骨髓细胞，备用。
       2.5试剂配制
       2.5.1凝胶用琼脂糖的配制正常熔点琼脂糖(NMA)用PBS液配成浓度为0.75%溶液;低熔点琼脂糖(LMA)用PBS液配成浓度为0.6% 溶液。室温储存备用。
       2.5.2细胞裂解液配制先配制贮备液(2.5 mol/L NaCl,100 mmol/L Na2EDTA,10 mmol/L Tris-HCl, pH 10.0),室温保存。应用液在实验前新鲜配制,取上述贮备液89 ml加入1% TritonX-100,1 ml和10%DMSO,10 ml定容至100 ml置4℃冰箱中预冷备用。
       2.5.3DNA解旋液(即电泳液)的配制先配制贮备液:NaOH配成终浓度为10mol/L溶液(贮备溶A);Na2EDTA配成终浓度为200 mmol/L溶液(贮备溶B);应用液临用前新鲜配制:取贮备溶A液30 ml加贮备溶B液5.0 ml再加双蒸水至1 000 ml,4℃冰箱放置备用。
       2.5.4中和液和染色液的配制取Tris用双蒸水成浓度为0.4 mol/L中和液,用浓盐酸调pH至7.5,室温保存。取溴化乙锭配成终浓度为200 μg·ml-1染色储备液(×10),贮于棕色瓶内4℃保存。临用前倍稀释。
       2.6 单细胞电泳
       2.6.1凝胶制片参照Singh等介绍的“三明治”铺胶法[7]有所改进[8，9]。采用磨沙载玻片,NMA(0.75%)50 μl铺第1层胶;制备好的细胞混悬液5μl与45 μl LMA(0.6%)迅速轻轻混匀后铺作第2层胶;最后再于第2层胶上铺1层50 μl LMA(0.6%)的第3层胶;其中每层胶都需用盖玻片压片。
       2.6.2细胞溶解将铺好三层胶面的载玻片，揭去盖玻片,轻放到方形盒中，倒入新鲜配制预冷的细胞裂解液，保证液体浸没玻片表面,放入4℃冰箱中，避光裂解1 h。
       2.6.3DNA解旋、电泳取出玻片,放置在水平电泳槽中,倾入新配制预冷的DNA解旋液,使液面浸没所有玻片,避光解旋20 min。DNA解旋结束后,室温下对电泳槽通电。调节电压为25 V(定压),电流180 mA,电泳20 min。
       2.6.4中和、染色、镜检电泳结束后将凝胶片用中和液中和漂洗3次,每次1 min。中和后的凝胶片,在胶体表面滴加50 μl 20 μg/ml的溴化乙锭,盖上盖玻片。染色后的样本在24 h内在荧光显微镜下用515~560 nm的激发光观察,每个载玻片观察约50个细胞,并测量细胞彗星影像的尾长。
       2.6.5统计学方法参照McKelvey-Martin等介绍的方法[10],并加以改进:根据彗星影像的尾长,把细胞损伤分为不同的等级,正常:< 20 μm;Ⅰ级损伤:20~40 μm;Ⅱ级损伤:40~60 μm;Ⅲ级损伤:60~80 μm;Ⅳ级损伤:≥80 μm。再统计不同剂量组的不同损伤等级细胞数。最后采用SPSS15.0统计软件进行数据分析[9]。
       2.7 细胞周期、凋亡检测取骨髓细胞，200目筛网过滤,用 PBS洗涤2次后70%冷乙醇固定，-20℃保存。上机前PBS洗涤，制成细胞悬液，加入含RNA酶的碘化丙啶(PI)染液，4℃ 30 min，经300目尼龙网滤过后，上流式细胞仪测定各组细胞凋亡率，每个样本获取10 000个细胞，以分析软件CELLQuset及ModFit 2.0分析结果。
       3结果与讨论
       3.1 单细胞电泳结果山茱萸几种提取部位对D-半乳糖所致DNA链断裂作用的影响结果见表2。表2各组骨髓细胞DNA损伤情况由表2可知，D-半乳糖可引起小鼠骨髓细胞DNA损伤，与正常对照组比较，差异显著(P<0.05),且Ⅲ、Ⅳ级(中重度)损伤细胞数较多。几种药物组表现出一定的保护作用，其中石油醚溶剂萃取部位效果最佳，Ⅲ、Ⅳ级(中重度)损伤的细胞数几乎为零。不同实验组小鼠骨髓细胞DNA的拖尾率见表3。表3不同组骨髓细胞DNA的拖尾率由表3可见，模型组小鼠骨髓细胞DNA的拖尾率较正常对照组显著增高，说明D-半乳糖能造成小鼠骨髓细胞DNA损伤而发生拖尾，山茱萸几种提取部位拖尾率较模型组低，表现出一定的保护作用，其中石油醚萃取部位作用最为明显。单细胞凝胶电泳技术是近年来广泛运用的一项新的有核细胞DNA损伤检测方法[9]，能灵敏地反映细胞中DNA损伤情况，本实验成功地运用单细胞凝胶电泳技术。结果提示，D-半乳糖模型小鼠骨髓细胞DNA拖尾率高，反映了D-半乳糖对小鼠骨髓细胞DNA的损伤，而山茱萸几种提取部位表现出一定的保护作用，该结果与前期以自然衰老小鼠为对象的实验结果相符[6]，说明了D-半乳糖化学致衰模型小鼠同自然衰老模型小鼠，DNA有一定的损伤，证实了文献报道的衰老与DNA损伤有关[11，12]，山茱萸几种提取部位尤其是石油醚萃取部位能减轻衰老模型小鼠骨髓细胞DNA的损伤，可能是其抗衰老作用机制所在。
       3.2流式细胞仪检测结果各组小鼠骨髓细胞凋亡情况见表4，图1。表4各组老年小鼠骨髓细胞凋亡率图1各组小鼠骨髓细胞流式细胞仪检测图由表4、图1可见，D-半乳糖模型小鼠与正常对照组相比骨髓细胞有一定的凋亡，凋亡率差异显著，山茱萸制品正丁醇萃取部位、石油醚萃取部位用药组骨髓细胞凋亡率与模型组相比，则明显降低。反映了山茱萸提取部位对D-半乳糖模型小鼠骨髓细胞的保护作用。细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制控制的主动死亡过程。细胞凋亡的一个显著特征就是细胞染色质的DNA降解，反之，当DNA损伤发生后，细胞通过一系列的应答反应，包括细胞周期停滞，DNA修复以及细胞凋亡等，使基因组的稳定性得以维持，因此细胞凋亡与DNA损伤间有着密切的关系。本研究提示，D-半乳糖模型小鼠骨髓细胞有凋亡发生，山茱萸提取部位表现出保护作用，该结果反映了山茱萸提取部位对骨髓细胞的保护作用，也间接反映了山茱萸提取部位对小鼠骨髓细胞DNA的保护作用。
       骨髓是中枢免疫器官，是各种免疫细胞的发源地，骨髓细胞DNA的结构和功能对于骨髓细胞至关重要。山茱萸是中医临床常用的滋阴补肾药物之一，具有提高免疫功能的作用。本研究山茱萸提取部位对骨髓细胞表现出了保护作用，前期研究也表明了山茱萸提取部位尤其是多糖、石油醚萃取部位对环磷酰胺免疫低下小鼠非特异性免疫功能、特异性体液免疫功能、特异性细胞免疫功能有影响，对自然衰老小鼠脾脏、胸腺结构有保护作用(另文发表)，因此山茱萸多糖和石油醚萃取部位可能是山茱萸增强免疫作用的主要活性部位，其作用机制可能与影响免疫细胞DNA有一定的关系。
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