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       【摘要】 
       目的动态观察清营解表合剂对流感病毒感染小鼠Th类细胞因子表达的影响，探讨该方抗流感病毒感染的免疫机制。方法以流感病毒亚洲甲型鼠肺适应株(A/PR/8/H1N1)感染小鼠为模型，采用SABC免疫组织化学法动态观察清营解表合剂干预治疗后肺组织细胞因子白介素-6(IL-6)，白介素-10(IL-10)及肿瘤坏死因子-β(TNF-β)表达水平的变化。结果流感病毒感染小鼠后，感染模型组IL-6，IL-10及TNF-β表达各时间点均高于正常空白组，在第6天IL-6，TNF-β表达均达峰值，在第3，6天升高差异显著有统计学意义。药物干预后，清营解表合剂组IL-10表达逐渐升高，第6，9天较感染模型组升高差异显著。清营解表合剂组IL-6，TNF-β表达水平各时间点较感染模型组均下降,第6天下降差异有统计学意义。结论清营解表合剂通过调节流感病毒感染小鼠Th类细胞因子的表达水平而提高机体免疫功能，恢复机体的抗感染免疫平衡。
       【关键词】  清营解表合剂;流感病毒;细胞因子;免疫功能
       Abstract：ObjectiveTo explore the immune mechanism of Qingying Jiebiao Heji in resisting influenza virus infection by dynamically observing its effect on the expressions of Th cytokine in lung tissue section of the mice infected by influenza virus.MethodsInfluenza virus(A/PR/8/H1N1) infected mice was adopted as model and SABC immunohistochemistrial method was used to dynamically observe the changes of expression levels of IL-6,IL-10 and TNF-β in lung tissue section after giving Qingying Jiebiao Heji treatment.ResultsAfter the mice were infected by influenza virus, the expression levels of IL-6，IL-10 and TNF-β in model group was higher than those of control group , of which IL-6，TNF-β reached the peak on the sixth day. After giving the treatment, the expression of IL-10 in Qingying Jiebiao Heji treated group was increased and the increase was remarkable on the sixth and ninth day, compared with those of model group. The expression levels of IL-6，TNF-β in Qingying Jiebiao Heji treated group was decreased in the different time and the decrease became remarkable on the sixth days, compared with those of model group.ConclusionQingying Jiebiao Heji can increase the immune function and recover the immune balance of the mice infected by influenza virus by adjusting the expression level of Th cytokine.
       Key words：Qingying Jiebiao Heji ; Influenza virus ; Cytokine; Immune function
       流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病之一，其致病力和传染性强者，可造成大流行、危及生命，中医将其归为“温病”范围。中药在抗流感病毒方面有其独特的优越性，既可直接抑制和灭活流感病毒又可通过调节机体免疫网络而起到抗流感病毒作用。临床验方清营解表合剂由金银花、连翘、白薇、生地、麦门冬等中药组成，具有辛凉解表、清营透邪等功效，用于偏于内热体质的感冒患者出现发热、头痛、咽痛等症，效果显著。 本实验采用A/PR/8/H1N1感染小鼠病毒性肺炎模型，免疫组织化学染色方法检测与流感病毒感染炎症反应相关的一些主要细胞因子IL-6,IL-10及TNF-β的动态表达水平，从而探讨清营解表合剂抗流感病毒的免疫学药效机制。
       1材料与仪器
       1.1动物BALB/c小鼠、封闭群，SPF级，雌雄各半，体质量18～20 g，共120只，购自山东大学实验动物中心。购入后置山东中医药大学实验中心动物室(国家三级)饲养。
       1.2病毒流感病毒亚洲甲型鼠肺适应株(A/PR/8/H1N1)，由国家流感中心病毒所提供，鸡胚传代后，血凝滴度为1∶64，-70℃冻存备用。
       1.3试剂与用药兔抗小鼠IL-6多克隆抗体，兔抗小鼠IL-10多克隆抗体，兔抗小鼠TNF-β多克隆抗体，生物素化山羊抗兔IgG，SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司产品。清营解表合剂：由山东中医药大学中鲁医院药剂科提供。实验时配制成浓度为0.5 g/ml混悬液，20 g/(kg·d)(相当于成人临床等效剂量);病毒唑，北京市永康药业有限公司产品，批号：20020109，用时以无菌生理盐水配制成2 mg/ml，0.05 g/kg·d。
       1.4器材病理切片机(Leica)，日本OLYMPUS BX41光学显微镜，OLYMPUS C-4000ZOOM 数码相机照相，Image-Pro Plus Version4.5图像分析软件，超净工作台、微量加样器等。
       2方法
       2.1动物分组将小鼠分为正常对照组、感染模型组、病毒唑对照组、清营解表和剂组，各组按感染后3，6，9，12 d不同时相各分为4小组，每小组6只。
       2.2造模方法各组实验小鼠用乙醚轻度麻醉后，正常对照组以25 μl生理盐水滴鼻，其余三组分别以25 μl A/PR/8/H1N1株病毒液滴鼻，血凝滴度为1∶64。
       2.3给药方法感染2 h后给药，各组每只小鼠每次0.4 ml灌胃，1次/d，正常对照组、病毒唑对照组、感染模型组灌服生理盐水0.4 ml，清营解表组灌服清营解表合剂混悬液0.4 ml。病毒唑对照组腹腔注射利巴韦林0.5 ml，其余各组腹腔注射等量生理盐水。
       2.4指标检测 分别于感染后第3，6，9，12天，先禁食不禁水8 h以上，脱颈处死各组小鼠，摘取左肺，生理盐水洗涤两次，以10%甲醛固定，按常规方法石蜡包埋。制成5 μm厚度连续切片。
       2.4.1肺组织TNF-β检测(SABC法) 切片脱蜡至水，3%H2O2室温10 min灭活内源性酶，水洗5 min×3次。采用煮沸热修复法修复抗原20 min。自然冷却后滴加5%BSA 封闭液，室温20 min。滴加兔抗小鼠TNF-β抗体(1∶100倍稀释)，湿盒内4℃ 过夜，每一批染色均设阴性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。次日取出湿盒至室温，PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 22 min。PBS洗2 min×3次。滴加试剂SABC，37℃ 20 min。PBS洗5 min×4次。DAB室温显色11min，蒸馏水洗涤。脱水、透明、中性树胶封片。用OLYMPUS BX41光学显微镜观察，每张切片任选5个高倍视野(400×)，用OLYMPUS C-4000ZOOM 数码相机采集图像(光亮度设定一致)，用Image-pro plus 4.5图像分析系统对结果进行半定量分析，测定每个肺组织的阳性颗粒(棕黄色)的积分光密度(IOD)，以均值作为该样本TNF-β的相对表达量，IOD值越大，说明其蛋白表达越多。
       2.4.2肺组织IL-6,IL-10检测(SABC法)兔抗小鼠IL-6(1∶50倍稀释),IL-10(1∶100倍稀释)，过程同上，DAB显色时间分别为8 min，5 min。
       2.5统计方法数据以±s表示，数据统计以SPSS 13.0统计分析软件进行，样本间均数比较用单因素方差分析，两两比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
       3结果
       3.1清营解表合剂对流感病毒感染小鼠肺组织IL-6动态表达的影响结果显示，造模后，感染模型组IL-6表达各时间点均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，在第6天达峰值，第9天开始出现下降趋势;药物干预后，病毒唑组、清营解表合剂组其表达较感染模型组均有下降趋势;第6天清营解表组较模型组下降显著有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。表1清营解表合剂对流感病毒感染小鼠肺组织IL-6(IOD)动态表达的影响
       3.2清营解表合剂对流感病毒感染小鼠肺组织IL-10动态表达的影响结果显示造模后，感染模型组IL-10表达各时间点较正常对照组有升高趋势，第3，6天升高差异有统计学意义(P<0.05);药物干预后，病毒唑组、清营解表合剂组其表达较正常对照组均升高，差异在第3，6，9天有统计学意义(P<0.01);第3天，病毒唑组较感染模型组升高显著(P<0.05);第6，9天病毒唑组，清营解表组均较感染模型组升高差异显著(P<0.01，P<0.05);病毒唑组，清营解表组第12天表达水平较第6天下降显著(P<0.05)。结果见表2。表2清营解表合剂对流感病毒感染小鼠肺组织IL-10(IOD)动态表达的影响
       3.3清营解表合剂对流感病毒感染小鼠肺组织TNF-β动态表达的影响结果显示：造模后，感染模型组TNF-β表达各时间点均高于正常空白组，第3，6天升高差异有统计学意义(P<0.01)，在第6天达峰值，第9，12天开始下降，均较第6天下降显著有统计学意义(P<0.01);药物干预后，病毒唑组、清营解表合剂组其表达较感染模型组均有下降趋势，第6天清营解表组较感染模型组下降显著有统计学意义(P<0.05);清营解表组第12天较第3，6天下降有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结果见表3。表3清营解表合剂对流感病毒感染小鼠肺组织TNF-β(IOD)动态表达的影响
       4讨论
       流感病毒主要是细胞内感染，其中CD4+T细胞识别活化在机体抗病毒感染免疫的启动和调控中起关键作用，不仅辅助和调节特异性抗体和杀伤性T细胞的产生，同时其本身也可分泌抗病毒细胞因子，发挥重要的效应作用[1]。
       根据CD4+T细胞所分泌的细胞因子不同，将其分为Th0,Th1和Th2三种亚型。Th1细胞是一类辅助性CD4+T细胞，主要偏向于分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等Th1型细胞因子。其中肿瘤坏死因子-β主要由活化的T细胞产生，又称淋巴毒素;TNF-β和TNF-α的生物学性质和作用极其相似，目前研究较多的是TNF-α，研究[2]表明TNF-α是重要的致炎细胞因子，其在急性肺损伤与ARDS炎症反应的始动与发展过程中起很重要的作用，对肺脏具有强烈的毒性。Th2细胞偏向于分泌IL-4，IL-5，IL-6，IL-10等Th2型细胞因子。其中IL-6由激活的巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞分泌，能被IL-1β和TNF-α诱导;IL-6的生物学活性具有明显双重性，不仅作用于免疫活性细胞，还参与炎症反应，是主要促炎细胞因子之一;当肺组织在炎症刺激、挫伤等因素的作用下，肺泡灌洗液、血清中IL-6水平显著升高并持续较长时间[3]。IL-10主要由淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细胞产生。在炎症、免疫及增殖等方面均有调节作用，是一种多功能的细胞因子。在肺的急性炎症期，IL-10具有抑制IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和MIP-1 等炎症介质表达，是一种重要的抗炎性细胞因子，对免疫应答主要起抑制作用。研究[4]显示流感病毒感染能导致小鼠血清IL-10表达随时间的推延日渐升高，提示抗炎机制的启动是作为对机体的保护作用，用药后可进一步促进IL-10的表达水平从而增强抗病毒感染作用。
       本实验结果显示，小鼠在流感病毒感染后的不同时相肺部细胞因子表达水平不同。在流感病毒感染后，感染模型组细胞因子IL-6，IL-10及TNF-β表达各时间点均高于正常空白组;在第6天IL-6，TNF-β表达均达峰值，在第3，6天升高差异显著有统计学意义;说明在感染中期，病毒在肺组织中大量繁殖，机体炎症损伤及免疫功能紊乱最严重。清营解表合剂组IL-6，TNF-β表达水平各时间点较感染模型组均下降，第6天下降差异显著;IL-10表达逐渐升高，第6，9天较感染模型组升高差异显著。提示清营解表合剂能够通过促进感染小鼠抗炎性细胞因子IL-10的表达，同时抑制促炎性细胞因子IL-6，TNF-β的过量产生，调控流感病毒感染小鼠Th类细胞因子的表达水平而提高机体免疫功能，恢复机体的抗感染免疫平衡，达到抗病毒的作用。
       【参考文献】
         　[1]瞿介明，何礼贤，胡必杰.免疫低下与感染[M].上海: 上海科学技术文献出版社,2004: 13.
       
       [2]许淑云，刘晓晴.细胞因子和急性肺损伤[J].国外医学·呼吸系统分册，2001，21(4)：197.
       
       [3]周园，杜惠莲，王任群.肺损伤中炎性细胞因子作用的研究进展[J].卫生职业教育，2007，25(12)：143.
       
       [4]王成祥，高桂新，魏守超，等.益气清瘟解毒合剂对流感病毒FM1感染小鼠肺中IFN-γ,TNF-α,IL-10 及IL-6蛋白动态表达的影响[J]. 中国中药杂志，2005，30(7)：541.