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       【摘要】 
       目的探讨连作对牛膝中甾酮及三萜类成分含量的影响。方法采用HPLC/DAD/ELSD联用的方法测定了牛膝样品中4种甾酮类成分和4种三萜类成分的含量。结果多年与小麦复种连作的牛膝药材中两类成分的含量明显高于麦茬地中首次种植的牛膝药材。结论连作对牛膝药材的品质提高可起到促进作用。
       【关键词】  药用植物栽培;牛膝;连作;高效液相色谱
       牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，是著名的四大怀药之一，具有补肝肾强筋骨的作用，久服可轻身耐老。作为传统道地药材，牛膝在河南有着悠久的种植历史，尤其在黄河故道武陟、温县一带，牛膝的种植地都有近百年的历史。近年来，随着牛膝临床用量的扩大与价格上涨，很多农民开始占用其他耕地种植牛膝，在这一过程中也暴露出一些问题。根据相关文献报道，在道地产区，牛膝在连作时其地上部位虽然长势一般，但地下部分却生长良好，根皮光滑，须根和侧根很少，与生茬地中种植的牛膝药材相比，多年重茬地块中种植的牛膝药材其外观品质具有明显优势[1]。为了研究连作是否也会对牛膝药材的内在品质产生影响，作者在温县栽培基地的生麦茬地及多年进行牛膝-小麦复种连作的地块中进行了牛膝栽植实验，并对两个地块的采收药材进行了对比，通过测定牛膝中的两类活性成分(甾酮和三萜类成分)来分析牛膝药材的内在品质差异。
       1仪器与试药
       1.1仪器 Agilent 1100 系列高效液相色谱仪，二极管阵列检测器(DAD)，美国安捷伦公司;Alltech ELSD2000检测器，美国Alltech公司;空气压缩机，天津蓝珂科技实业公司;HP Chemstation 色谱工作站，美国惠普公司。
       1.2试剂与药材乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)，异丙醇(色谱纯，美国Tedia公司)，Milli-Q超纯水(美国Millipore 公司)。对照品：甾酮类成分：水龙骨甾酮(1)， β-蜕皮甾酮(2)， 25-R 牛膝甾酮(3)， 25-S 牛膝甾酮(4);三萜类成分：人参皂苷Ro (5)， 竹节参皂苷Ⅳa (6)，姜状三七苷R1(7)， 28-去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa (8)。所有对照品均从河南省武陟县产牛膝中分离得到，结构经NMR，MS数据及文献对比确证。在本实验色谱条件下经归一化法检测纯度≥98%。实验材料采自河南温县，分别为麦茬地头年种植的牛膝药材和牛膝-小麦多年复种连作的牛膝药材，均由作者鉴定并经中国药科大学李萍教授审核确证，凭证标本存放于中国药科大学生药学教研室。药材经烘箱干燥后粉碎，过3号筛。
       2方法与结果
       2.1色谱条件色谱柱为 Agilent Zorbax C18(125 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温采用程序升温：0~25 min，20 ℃，25~70 min，38 ℃。流动相由乙腈(B)-5%异丙醇(含0.1%甲酸)(A)混合组成，梯度洗脱程序：0～25 min，10%B;25～28 min，10%～30%B;28～53 min，30%B;53～63 min，30%～46%B，63～70 min，46% ～58%B;流速：0.9 ml·min-1。DAD检测波长242 nm;ELSD参数：检测器漂移管温度112 ℃，载气流速3.2 L·min-1。进样量15 μl，理论塔板数以人参皂苷Ro计算不低于4 800。对照品和样品的色谱图见图1。
       2.2线性关系的考察分别精密称取对照品水龙骨甾酮(1)， β-蜕皮甾酮(2)， 25-R 牛膝甾酮(3)， 25-S 牛膝甾酮(4)，人参皂苷Ro (5)， 竹节参皂苷Ⅳa (6)，姜状三七苷R1(7)， 28-去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa (8)适量，用甲醇制成混合对照品溶液使质量浓度分别为水龙骨甾酮(157 mg·L-1)， β-蜕皮甾酮(445 mg·L-1) 25-R 牛膝甾酮(112 mg·L-1), 25-S 牛膝甾酮(146 mg·L-1)，人参皂苷Ro(2 570 mg·L-1), 竹节参皂苷Ⅳa (2 600 mg·L-1),姜状三七苷R1 (795 mg·L-1), 28-去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa (750 mg·L-1)，精密吸取上述混合对照品溶液，加甲醇分别配置成原浓度的1，2/5，1/5，1/10，1/20，1/50，1/100的梯度混合对照品溶液。按“2.1 ”项下色谱条件，对各浓度对照品溶液分别进样15 μl。以峰面积数值对浓度数值进行线性回归，得甾酮类成分回归方程，以峰面积的常用对数值对浓度的常用对数值进行线性回归，得三萜类成分回归方程见表1。表1对照品回归方程
       2.3稳定性实验取牛膝药材，按“2.7”项下操作制备供试品溶液，于0，2，8，12，24，48 h按“2.1”项下色谱条件分别测定，计算各峰峰面积RSD，结果表明供试品溶液在48 h内稳定。
       2.4精密度实验取中间浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，计算各色谱峰峰面积(Pa)的相对标准偏差(RSD)来考察日内变异，水龙骨甾酮(1)， β-蜕皮甾酮(2)， 25-R 牛膝甾酮(3)， 25-S 牛膝甾酮(4)，人参皂苷Ro (5)， 竹节参皂苷Ⅳa (6)，姜状三七苷R1(7)， 28-去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa (8)的日内精密度分别为1.49%，1.23%，0.53%，1.54%，3.26%，3.87%，3.54%，1.07%;日间变异通过连续进样3 d，每天两次测定，其精密度分别为0.83%，1.57%，2.48%，2.55%，4.72%，4.16%，3.42%，4.10%。结果表明本方法精密度良好。
       2.5重复性实验取牛膝药材，按“2.7”项下操作平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件分别测定水龙骨甾酮(1)， β-蜕皮甾酮(2)， 25-R 牛膝甾酮(3)， 25-S 牛膝甾酮(4)，人参皂苷Ro (5)， 竹节参皂苷Ⅳa (6)，姜状三七苷R1(7)， 28-去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa (8)的峰面积，计算各峰峰面积RSD分别为2.16%，2.43%，2.77%，2.68%，3.73%，3.45%，4.81%，4.64%，结果表明该方法重复性良好。
       2.6回收率测定精密称取已知含量的牛膝药材粉末0.4 g，分别加入适量的对照品，按“2.7”项下操作平行制备供试品溶液3份，按“2.1”项下色谱条件分别测定水龙骨甾酮(1)， β-蜕皮甾酮(2)， 25-R 牛膝甾酮(3)， 25-S 牛膝甾酮(4)，人参皂苷Ro (5)， 竹节参皂苷Ⅳa (6)，姜状三七苷R1(7)， 28-去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa (8)的平均回收率分别为97.9%，96.2%，97.9%，96.9%，88.9%，98.3%，97.0%，97.2%;RSD分别为4.46%，1.33%，4.10%，3.03%，3.51%，3.66%，3.84%，4.47%。
       2.7样品测定取药材粉末约0.8 g，精密称定，置50 ml圆底烧瓶中，加甲醇20 ml，85 ℃回流提取3 h，放冷，滤过，滤液回收甲醇至干，残渣加水10 ml使溶解，以15 ml水饱和正丁醇萃取3次，萃取液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至2 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，以15 μl的进样量按上述色谱条件进样分析，记录各色谱峰峰面积，每个样品重复3次，峰面积取平均值，按外标法计算各对照品在药材中的含量。结果见表2。表2连作对牛膝中甾酮及三萜类物质含量的影响图1生茬及连作牛膝样品HPLC图
       3讨论
       本文首次运用HPLC等现代科学方法，测定了生茬与连作牛膝中甾酮及三萜类物质的含量，探讨了连作对牛膝药材内在品质的影响。由实验的结果可以看出，麦茬地中首次种植的牛膝其药材中皂苷含量(1.046 2 mg·g-1)与甾酮含量(0.540 1 mg·g-1)均低于多年牛膝小麦复种连作地中种植的牛膝药材(2.438 1 mg·g-1，0.749 3 mg·g-1)，与牛膝在种植过程中的外观品质变化规律一致，这说明在牛膝种植过程中，连作对其外观与内在品质均有所提高。在河南温县与武陟等地区，生茬地牛膝的外观劣势所造成的经济损失严重打击了药农扩大种植面积的积极性，极不利于该药材种植产业的发展。对于牛膝这种随着地块种植年限的增加品质得以提高的现象，我们暂且将其称之为牛膝的“连作增益”效应，至于其质量的提高是否与种植年限呈严格的正相关关系，还需要在今后的实验中进一步进行考证。值得一提的是，多年的连作究竟对牛膝生境造成了什么影响?这种影响又使牛膝的生理代谢过程产生了哪些变化，并最终引起了牛膝根系生长优势的这种连作增益效应?在古书中牛膝就是作为地黄种植后土壤修复的首选作物，如《本草乘雅半偈》[2,3]载“种植之后，其土便苦，次年止，可种牛膝……足十年，土味转甜，始可复种地黄……”，古人选择牛膝是出于偶然还是在长期的观察中得出的经验?牛膝连作增益的原理是否可以运用到其他存在严重的连作障碍问题的药用植物中?这一系列问题都有待进一步研究。
       【参考文献】
         　　[1]王新民，张重义，李宇伟，等.怀牛膝GAP栽培技术标准操作规程[J].安徽农业科学，2006，34(5):922.
       
       [2]卢之颐.本草乘雅半偈[M].北京:人民卫生出版社，1986.
       
       [3]温学森，杨世林，魏建和，等.地黄栽培历史及其品种考证[J].中药材，2002，33(10):946.