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       【摘要】 
       目的探讨灯盏细辛提取物对痴呆大鼠学习记忆能力及胆碱酯酶活性的影响。方法Wistar大鼠42只，随机分为5组;用双侧脑室注射β淀粉样蛋白联合腹腔注射D-半乳糖方法建立痴呆大鼠模型。采用Morris水迷宫方法检测大鼠学习记忆能力、比色法检测乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BuChE)活性。结果与正常组和假手术组相比，模型组大鼠在定向航行和空间探索中逃避潜伏期时间和穿越平台时间延长，穿越平台次数减少(P<0.05);脑组织中AChE和BuChE活性升高，血浆中AChE和BuChE活性降低(P<0.05)，经过灯盏细辛治疗后痴呆大鼠学习记忆能力有所提高，胆碱酯酶活性趋向于正常(P<0.05)。结论灯盏细辛能够提高痴呆大鼠学习记忆能力，促进胆碱酯酶活性趋向于正常。
       【关键词】  灯盏细辛;痴呆;学习记忆能力;胆碱酯酶;大鼠
       Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of Herba Erigenomtis(HE) extract on learning and memory ability and cholinesterase activity in rats with dementia.MethodsWistar rats were randomly divided into 5 groups. The animal model with dementia was produced by bilateral intracterthroventricular injection with β-amyloid peptide (Aβ)25-35 and abdominal cavity injection with D-galactose. Learning and memory ability of rats was detected by Morris Water Maze test, and the activities of acetycholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE) were measured by Ellman"s colorimetric method.ResultsIn the rats with dementia in the model group as compared with normal and sham operation groups, the escaping latent period and the time in passing the platform were obviously increased (P<0.05), and the times of crossing the platform significantly were declined (P<0.05); the activities of AChE and BuChE were increased in brain tissues and decreased in plasma (P<0.05). After treatment by HE extract, the ability of learning and memory was improved in the rats with dementia and the activity of cholinesterase in brain tissues and plasma was shown a tendency to recover to normal level (P<0.05).ConclusionHE extract may improve the learning and memory ability of the rats with dementia and show a tendency to recover the activity of cholinesterase to normal level.
       Key words： Herba Exigeromtis(HE);Dementia;Learning and memory ability;Cholinesterase;Rats
       阿尔茨海默病(Alzheimer"s disease，简称AD)是一种以原发性神经元变性为基础的神经退变性疾病，包括学习、记忆、情感、认知的障碍，以及工作、生活能力的减退。由于AD的发病机制未完全阐明清楚，对AD病人的防治带来一定困难，目前国内外尚无治疗AD的有效特异药物。近年来的研究表明，灯盏细辛对脑损伤具有多种保护作用，如恢复脑损伤急性期的血液供应、改善血循环、改善缺血神经组织代谢紊乱状况、抑制神经元凋亡、降低细胞内钙浓度、促进神经再生、对恢复期缺氧神经元具有直接保护作用等[1]。为研究灯盏细辛在AD治疗中的作用及其治疗机制，本研究观察了该药对类AD大鼠模型学习记忆能力和胆碱酯酶活性的影响。
       1材料与仪器
       1.1药物与试剂实验用灯盏细辛提取物为灯盏乙素，浅棕色粉末。灯盏细辛原药材采自于贵州雷山县，由贵阳医学院药学院生药学教研室鉴定。灯盏细辛药材加10倍水，煎煮3次，30 min/次，煎煮液浓缩至相对密度为1.10 (50℃ )，加乙醇使含醇量为 55%，搅拌，放置，滤过，滤液减压回收乙醇至相对密度1.11(50℃ )，用盐酸调pH值至2，于55℃保温6 h，滤过，真空干燥即得;脑复康0.4 g/瓶，为杭州民生药业集团有限公司产品，国药准字H33021967，批号T09B519;Aβ25-35 1 mg/瓶，Sigma公司生产，产品号A4559，批号108K4794;D-半乳糖 25 g/瓶，为上海蓝季科技发展有限公司产品;乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BuChE)试剂盒购自Sigma公司。
       1.2动物Wistar大鼠42只，体质量300~350 g，雌雄各半，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK (Q) 200220001。
       1.3仪器ELx800UV型酶标仪, Bio-Tek公司生产;DNS-2型脑立体定位仪，深圳市瑞沃德生命科技有限公司生产;Morris水迷宫视频分析系统，中国医学科学院药物研究所生产，图像处理为BI2000图像分析系统;5810R型台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司生产。
       2方法
       2.1模型建立、实验分组及药物治疗Wistar大鼠(雌雄各半)均进行Morris水迷宫测试，学习记忆能力相当，随机分为正常对照组(n=6)，假手术组(n=6)，模型组( n= 10) ，灯盏细辛组(n=10)和脑复康组(n=10)。后三组大鼠经10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔麻醉后用脑室定位仪固定头部，以前囟点为坐标，前囟点后3 mm，旁开2 mm，深3.3 mm为侧脑室注射点，定位后用颅骨钻钻开颅骨，微量进样器垂直进针，进行双侧脑室注射，缓慢注入二甲亚砜孵育72 h后的聚集态β-淀粉样蛋白(Aβ)25~35 (5μg/μl)各2 μl，留针10 min，缝合伤口，并给予磺胺嘧啶粉外敷抗感染，术后第2天给予1% D-gal 0.72 mg/(100g·d)腹腔注射，连续10 d。假手术组模拟模型组双侧脑室注射及腹腔注射等量生理盐水。其中灯盏细辛组从模型建立后按0.5%灯盏细辛2 ml/d进行灌胃，脑复康组同样按64 mg /ml混悬液2 ml/d灌胃;所有组别均在模型建立30 d后用水迷宫检测学习记忆能力;测试24 h后从大鼠股动脉取血，离心后吸取血浆;动物放血处死后在低温下取出左枕叶脑组织置-80°冰箱备用(测定胆碱酯酶活性)。
       2.2指标检测
       2.2.1学习记忆能力的测定水迷宫由圆形水池、安全岛和记录系统3部分组成，水池直径120 cm，桶高60 cm，水面高于安全岛 3 cm，水温(20±1) ℃，训练期间环境安静，迷宫参照物不变。池壁标记4个入水点，将水池分为4个象限，记录系统为BI2000系统的行为学检测模块，实验大鼠分别于给药治疗前后进行定向航行及空间探索实验，检测其学习记忆能力。即：第1～4天进行定向航行试验：每日将大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 象限顺序从各入水点靠池壁放入水中, 记录60 s 内大鼠从入水到爬上平台(固定于第I 象限) 所需时间即逃避潜伏期。每天连续测试4次，连续5 d，取其平均值。第5天撤去平台, 进行空间探索实验：记录大鼠第1次穿越原站台时间及1 min内穿过原站台位置的次数。
       2.2.2脑组织及血浆AChE和BuChE活性测定大鼠左枕叶脑组织精密称重，按1∶15的比例加入蛋白裂解液倒入匀浆器冰浴匀浆，将制备好的15%脑匀浆在4℃冷冻离心机上以12 000 r/min离心30 min后取上清液，用PBS按1∶13比例稀释;大鼠股动脉放血后以3 000 r/min离心15 min分离血浆，用PBS按1∶5比例稀释。按试剂盒说明操作，反应体系混匀，室温避光反应20 min，然后终止反应，在 412 nm波长测定各管吸光度 (用 PBS调零 )，按下列公式计算血浆及脑组织匀浆AChE和BuChE活性。(测定管-对照管)×系数(0.588)×稀释倍数
       2.2.3数据统计实验数据均以±s表示，采用SPSS11.5统计软件的单因素方差分析进行统计学显著性分析，组间差异显著性采用单因素方差分析中的LSD方法进行多重比较检验，P<0.05代表有显著性差异。
       3结果
       3.1定向航行测定与正常组和假手术组相比较，模型组大鼠在定向航行中平均逃避潜伏期的时间延长(P<0.05)，经过灯盏细辛和脑复康治疗后逃避潜伏期时间明显缩短(P<0.05)，灯盏细辛组平均逃避潜伏期时间的缩短较脑复康组明显，但尚无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。
       3.2空间探索距离的测定与正常组和假手术组相比，模型组大鼠第1次穿越平台时间明显延长(P<0.05)，平台穿越次数明显减少(P<0.05);经过灯盏细辛治疗后，第1次穿越平台时间较模型组缩短(P<0.05)，平台穿越次数增多(P<0.05);脑复康组治疗后亦有所改善，但无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。表1实验后各组大鼠定向航行平均逃避潜伏期时间
       3.3灯盏细辛对模型大鼠脑组织AChE和BuChE活性的影响与正常组和假手术组相比，模型组大鼠脑组织匀浆AChE和BuChE活性升高(P<0.05)，灯盏细辛治疗后，大鼠脑组织匀浆AChE和BuChE活性降低(P<0.05);脑复康组治疗后未见明显差异(P>0.05)。结果见表3。
       3.4灯盏细辛对模型大鼠血浆AChE和BuChE活性的影响与正常组和假手术组比较，模型组大鼠血浆AChE和BuChE活性降低(P<0.05)，灯盏细辛治疗后，大鼠血浆AChE活性升高(P<0.05)，BuChE活性有升高趋势，但尚无统计学意义(P>0.05);脑复康组治疗后大鼠血浆AChE和BuChE活性有升高趋势，但无统计学意义(P>0.05)。结果见表4。表2各组空间探索试验中第1次穿越平台时间和次数表3各组大鼠脑组织AChE和BuChE活性改变表4各组大鼠血浆AChE和BuChE活性改变
       4讨论
       中医认为AD属于“健忘”“痴呆”“呆病”“文痴”“善忘”等范畴，病位在脑，肾虚为本，与心肝脾功能失调密切相关[2]。灯盏细辛具有散寒解表、祛风除湿、活血舒筋、消积止痛之功效，取其芳香走串，行达表里，甘温性味，温阳通络之功，可化瘀活络，益气生精，健运脾胃，补益髓海，可见灯盏细辛能够作用于AD符合中医的理论基础。现代研究同时表明，灯盏细辛具有神经保护，对抗神经毒性物质等作用[3]。当前，有关灯盏细辛是否对老年性痴呆的记忆损伤起到保护作用、其机制是否通过改善胆碱能神经系统来发挥作用等方面的问题已引起高度重视。本实验采用的灯盏细辛提取物为灯盏乙素(野黄芩苷)，是迄今为止该药研究最多和最被公认的有效化学成分[4]。
       本研究中，我们选择的复合型痴呆模型不仅符合AD多因素参与的发病机制，而且能较好的体现中医有关老年性痴呆的病因病机。在Aβ和D-gal的协同作用下，大鼠的学习记忆能力减退，且毛色发黄，无精打采，行动迟缓，接近于脑窍失养的辨证，表明实验采用的模型建立方法是进行中药治疗AD研究的较为理想的一种。实验中，正常对照组与假手术组之间未见明显学习记忆能力的差别。本实验在造模后进行水迷宫行为学测试，结果可以看出，大鼠表现为定向航行的逃避潜伏期时间和训练5天后第1次穿越平台时间明显延长，平台穿越次数明显缩短，表明实验动物学习记忆能力受损。给予灯盏细辛后，能明显缩短痴呆大鼠的逃避潜伏期时间和穿越平台时间，并增加大鼠的平台穿越次数，表明其对于改善大鼠学习记忆能力方面有一定的预防和治疗作用。但与西药对照药物-脑复康相比，还未得到有明显统计学意义的结果。
       胆碱能系统功能损害在AD中起着重要作用，其中涉及到胆碱能神经递质- 受体系统及与该系统代谢相关的酶，如胆碱酯酶[5]。胆碱酯酶是一类丝氨酸水解酶，按照酶水解底物的专一性、水解速度的差异、对抑制剂敏感性、以及组织分布特点，可分为两类：一类为AChE，一类为BuChE。AChE和BuChE的水解底物-乙酰胆碱缺失的严重程度与痴呆密切相关，提示两者在AD的发病过程中起着重要的作用[6]。有假设提出Aβ前体(APP)基因突变或β分泌酶活性过高，产生过多分泌型A β，它在AChE启动及BuChE协助下与载脂蛋白E结合沉积于脑内，尤其是沉积在学习记忆中枢前脑基底核和海马区，使此部位胆碱能神经原损毁以至死亡，中枢及整个脑组织中ACh减少，出现智能障碍，是造成痴呆的机制之一[7]。尽管 AD患者脑组织中的AChE含量远高于BuChE，但是研究显示在接受胆碱能神经纤维支配的皮层及海马均有活化的BuChE[8]，随着AD的病情发展，BuChE活性进行性增加[9]。因此AChE和BuChE两者活性变化在一定程度上可以反映与AD紧密联系的胆碱能功能状况，并且许多研究已经发现在AD患者脑脊液、血浆和脑部特定区域存在ChE活性的改变[10]，可以作为AD的辅助诊断指标。
       本研究中我们采用改良Ellman比色法检测了大鼠左侧枕叶脑组织中两种胆碱酯酶活性，发现与正常组和假手术组比较，模型组大鼠脑组织AChE与BuChE活性显著升高(P<0.05)，在灯盏细辛治疗后有所降低(P<0.05);用同样的方法检测了大鼠血浆中同样两种酶活性，结果正好相反，与国内外许多研究结果一致，并且在实验中可以看出灯盏细辛较脑复康的作用略为明显。表明Aβ和D-gal产生协同损伤的作用，导致AChE与BuChE活性改变，造成胆碱能系统功能受损，而灯盏细辛能够改善AChE与BuChE活性，介入到胆碱能系统功能损害中起积极作用。本实验同时提示，灯盏细辛的此项影响有可能对于胆碱能系统功能异常引起的级联反应起到保护作用，这将在我们下一步的实验中得以证实。
       上述结果表明，灯盏细辛能够提高痴呆大鼠学习记忆能力，促进胆碱酯酶活性趋向于正常，对痴呆的治疗有一定重要作用。
       【参考文献】
         　[1]盛艳梅，张静，孟宪丽，等. 灯盏细辛有效组分对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞的影响[J].中药药理与临床，2008，24 (2):35.
       
       [2]崔德芝，张恭新，朱振铎.老年性痴呆的中医理论探讨.[J].山东中医杂志， 2006，25(10):655.
       
       [3]周素娟.灯盏细辛制剂药理研究进展及临床评价.[J].中国医院用药评价与分析， 2006，6(1):22.
       
       [4]万丽丽，郭澄. 野黄芩苷药动学研究进展[J].中国药房，2007，18(30):2385.
       
       [5]Giacobini E. Cholinergic function and Alzheimer"s disease[J].Int J Geriatr Psychiatry，2003 ，18(Suppl 1):S1.
       
       [6]Hu Y， Xia Z， Sun Q， et al . A new approach to the pharmacological regulation of memory: Sarsasapogenin improvesmemory by elevating the low muscarinic acetylcholine receptor density in brains of memory-deficit rat modls[J]. Brain Res， 2005， 26，1060 (1-2) : 26.
       
       [7]Pákáski M， Kálmán J.Interactions between the amyloid and cholinergic mechanisms in Alzheimer"s disease[J].Neurochem Int. 2008，53(5):103.
       
       [8]Mesulam M， Guillozet A， Shaw P， et al. Widely spread butyrylcholinesterase can hydrolyze acetylcholine in the normal and Alzheimer brain[J]. Neurobiol Dis， 2002， 9 (1) : 88.
       
       [9]Ballard CG， Greig NH， Guillozet-Bongaarts AL， et al.Cholinesterases: roles in the brain during health and disease[J].Curr Alzheimer Res. 2005，2(3):307.
       
       [10]Marquis JK， Volicer L， Mark KA， et al.Cholinesterase activity in plasma， erythrocytes， and cerebrospinal fluid of patients with dementia of the Alzheimer type[J].Biol Psychiatry， 1985，20(6):605.