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       【摘要】 
       目的观察连续灌胃给予苦茶碱对大鼠的毒性反应。方法苦茶碱分别按150，75，37.5 mg/kg 给大鼠连续灌服4周。停药1周,测量受试大鼠的体重，计算重要器官脏器系数，测定血液学及血液生化学指标,并作组织病理学检查。结果与空白对照组比较，口服高、中、低剂量苦茶碱4周对大鼠的体重增长、脏器系数、血液指标、血液生化学指标均无显著影响，病理学检查未见明显病变，停药后也未见延迟性毒性反应。结论苦茶碱长期用药对大鼠无明显毒性,按临床拟用剂量服用是安全的。
       【关键词】  苦茶碱;大鼠;长期毒性
       Abstract：Objective To observe the long-term toxicity of theacrine by continuously oral administration to rats.MethodsThree doses of theacrine 150, 75, 37.5 mg/(kg·d)-1 were given to rats by oral administration for 4 weeks. The body weight, organ coefficient, hematological and blood biochemical parameters were determined. The main organ pathological examination was performed.ResultsThe appearance and behavior, body weights, organ coefficient, the parameters of hematological and biochemical were not affected evidently compared with control group. The pathological examination didn’t discover drug toxicity related changes. No delayed toxic reaction after drug given was observed.ConclusionTheacrine has no significant toxicity in long-term toxicity test to rats, which inferrs that the drawing up dose in clinic is safe.
       Key words：Theacrine; Rats; Long-term toxicity
       苦茶是张宏达教授于1984年在云南金平发现的茶的新变种[1]，后来石祥刚等[2]根据其形态特征和含特殊生物碱，又将其升格为独立的种。化学成分研究发现其生物碱组成与茶不同，富含苦茶碱(1,3,7,9-四甲基尿酸，theacrine)[3]，结构如图1所示，茶多酚组成及含量与茶类似[4]。当地人将其加工成茶叶，日常饮用。药理活性研究显示，苦茶碱具有一定的镇静催眠[5]和消炎镇痛[6]作用。本实验观察大鼠长期口服苦茶碱单体对大鼠产生的毒性反应，为将苦茶开发为新的茶叶资源，或将苦茶碱开发为药物提供基础。
       1 材料与仪器
       1.1药物 苦茶碱纯品(纯度≥95%)，由中山大学生命科学学院植物资源实验室分离纯化。
       1.2 动物 健康SD大鼠，体质量为80~100g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证：SCXK(粤)2003-0002 粤监证字2007A003。　　图1苦茶碱结构式
       1.3 试剂 总蛋白、白蛋白、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、肌酐、尿素、血糖、胆固醇、碱性磷酸酶、甘油三酯测定试剂由北京中生北控生物科技股份有限公司生产。
       1.4 仪器ECOM-F6124半自动生化分析仪(德国eppendorf公司)，CELL-DYN3700血球计数仪(美国雅培公司)，BS110S电子天平(德国sartorius公司)，DM5000B型正置荧光显微镜(德国LEICA公司)。
       2 方法
       选取6~8周龄大鼠80只，体质量(90±10)g，雌雄各半，随机分成4组，每组20只。设150，75，37.5 mg/kg 3个剂量组及空白对照组，分别相当于人日常摄入量(62 mg)的170倍、85倍、42.5倍。每日上午灌胃给药1次，连续给药30 d，给药体积为1 ml/100 g。对照组给予等体积纯净水，给药时观察大鼠的一般状态，每周测体质量1次。末次给药禁食不禁水1 d后，各组选取大鼠10只(雌雄各半)，摘眼采血，以血球计数仪测定红细胞(RBC)，白细胞( WBC)，血小板( PLT)，血红蛋白( HGB)，中性粒细胞(NEU%)，淋巴细胞(LYM%)，单核细胞(MONO%)，嗜酸粒细胞(EOS%)，嗜碱粒细胞(BASO%)、红细胞压积(HCT)等血液学指标，半自动生化分析仪及配对试剂盒测定天门冬氨酸氨基转移酶(GOT)、丙氨酸氨基转移酶(GPT), 碱性磷酸酶( ALP)、尿素( UREA)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(Glu)、肌酐(Cre)、胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)等生化指标。对主要脏器进行尸检，取动物重要脏器：心、脑、肝、脾、肺、肾、肾上腺(单侧)、子宫、前列腺、卵巢(单侧)、睾丸(单侧)等称重，计算脏器系数。对上述主要脏器及胃、小肠、直肠、胸腺、附睾等进行病理组织学检查。各组余下大鼠停药观察7 d后，同法处理，并做相应检查。所得结果作统计学处理，t检验比较组间差异的显著性。
       3结果
       3.1对大鼠一般情况的影响 在整个实验过程中，各组大鼠给予受试药品期间外观体征无异常改变;行为活动正常，未见萎靡不振和运动失调现象;毛色有光泽、浓密且紧贴身体，无创伤、疥癣和湿疹等;口、眼、耳、鼻均无异常分泌物，无发炎或红肿现象;各用药组大鼠粪便无粘液，无稀烂，成形;尿量正常，颜色淡黄，均澄清透明。
       3.2对大鼠摄食量及体质量的影响 给药第2周起，苦茶碱各剂量组雄性大鼠的摄食量与同期空白对照组相比略有下降，苦茶碱味苦，雄性大鼠体质量较大，给药量也较大，一定程度影响了大鼠的摄食量。苦茶碱各剂量组雌性大鼠的摄食量基本无变化。停药1周后，各给药组雄性大鼠和雌性大鼠的摄食量与空白对照组相比无明显变化。结果见表1~2。表1大鼠喂养4周及停药1周对摄食量的影响表2灌胃给予苦茶碱30 d及停药7 d对SD系大鼠体质量的影响
       3.3对大鼠血液指标的影响 连续服用高、中、低剂量组苦茶碱4周，大鼠血液的白细胞(WBC)计数均有下降，与同期空白对照组相比具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，但均在大鼠的WBC计数的正常值范围内。大鼠血液的红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、淋巴细胞系(LY)、单核细胞系(MO)、凝血时间(CT)等指标与对照组比较均无显著性差异。停药1周，各剂量组的各项指标与对照组比较，均无显著性差异。结果见表3。表3大鼠经灌胃连续给予苦茶碱30 d对血液学参数的影响
       3.4 对大鼠血液生化指标的影响 连续给予苦茶碱4周，各组大鼠的生化指标见表4，苦茶碱各剂量组的丙氨酸氨基转移酶(GPT)、天门冬氨酸氨基转移酶(GOT)和胆固醇(CHO)的数值均有不同程度的下降，其中苦茶碱高、中、低剂量组的丙氨酸氨基转移酶(GPT)含量与空白对照组相比具有显著性差异(P<0.05，P<0.01或P<0.001)，但仍在大鼠总蛋白(TP)的正常值范围内;高剂量组大鼠总胆固醇含量下降，与同期空白对照组相比具有显著性差异(P<0.05)，数值仍在大鼠胆固醇(CHO)含量正常值范围内。苦茶碱各给药组的其它各项生化指标与空白对照组相比均无显著性差异(P>0.05)，且都在正常值范围内。
       给予苦茶碱4周停药1周时结果见表5，苦茶碱各剂量组的丙氨酸氨基转移酶(GPT)虽略减少，但与空白对照组相比无显著性差异(P>0.05)，且均在大鼠总蛋白(TP)正常值范围内;苦茶碱各剂量组肌酐的含量明显减少，与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，但均在大鼠肌酐的正常值范围内，对比给药4周肌酐值虽略有下降但与空白组相比无显著性差异(P>0.05)。苦茶碱各给药组的其它生化指标与空白对照组相比均无显著性差异(P>0.05)，且都在正常值范围内。与给药4周各指标相比，停药1周后，苦茶碱各剂量组大鼠的血液生化指标基本恢复正常。表4灌胃连续给予苦茶碱4周后大鼠生化指标的变化表5 灌胃给予苦茶碱4周停药1周后大鼠生化指标的变化
       3.5 对大鼠主要脏器系数的影响 连续灌胃给予苦茶碱4周和停药1周，苦茶碱低、中、高剂量组大鼠的各项脏器系数与空白对照组相比，均无显著性差异(P>0.05)，且均在正常值范围内，结果见表6。表6灌胃连续给予苦茶碱4周后大鼠内脏指数的变化
       3.6病理学检查给大鼠连续服用苦茶碱4周和停药1周后，处死大鼠，剖取大鼠的大脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、睾丸、前列腺、子宫、卵巢、附睾、胸腺、胃、小肠、直肠等脏器，进行肉眼观察，主要脏器外形、体积、色泽均正常。各脏器以10%福尔马林固定后，按常规方法做病理切片，显微镜观察。结果大鼠各脏器组织形态学均正常，与空白对照组相比，未见由于药物毒性引起的病理改变。
       4讨论
       以上实验结果表明，大鼠经灌胃连续给予高、中、低剂量苦茶碱4周及停药1周后，各组动物均未出现异常死亡。4周喂养实验对雄性大鼠的体重及摄食量有明显的影响，而对雌性大鼠影响较小，雄性大鼠体质量减轻明显，可能由于其味苦，影响大鼠的食欲。血液生化指标结果表明，给药4周时，苦茶碱各剂量组大鼠的血清GOT、GPT和CHO值下降，但仍在正常值范围内。苦茶碱各给药组的大鼠重要脏器指数与同期空白对照组相比，无显著性差异。病理检查结果表明，苦茶碱高、中、低剂量组各主要脏器大体解剖与组织学检查与同期空白对照组相比，无明显差异。
       综上所述，苦茶碱在高剂量(150 mg/kg)，为临床人用剂量170倍时，大鼠长期灌喂给药，未见明显毒性反应，表明苦茶碱毒性小，按临床拟用剂量服用是安全的。
       【参考文献】
         　[1]张宏达. 茶叶植物资源的订正[J]. 中山大学学报(自然科学版), 1984, 1: 10.
       
       [2]石祥刚，郑新强，宋晓虹，等. 关于苦茶的新组合[J].中山大学学报(自然科学版)，2008，47(6): 129.
       
       [3]叶创兴，林永成，苏建业，等. 苦茶 Camellia assamica var. kucha Chang et Wang 的嘌呤生物碱[J].中山大学学报(自然科学版), 1999, 38(5): 82.
       
       [4]王冬梅，杜丽丽，卢嘉丽，等. 苦茶 Camellia assamica var. kucha茶多酚的HPLC-DAD/MS分析[J].天然产物研究与开发, 2006, 18: 978.
       
       [5]Jie-Kun Xu，Hiroshi Kurihara，Liang Zhao，et al. Theacrine, a special purine alkaloid with sedative and hypnotic properties from Cammellia assamica var. kucha in mice[J]. Journal of Asian Natural Products Research, 2007, 9(7): 665.
       
       [6]宋晓虹，王园园，叶创兴，等. 苦茶碱的制药应用[P].中国专利：CN 101543498，2009-9.