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       【摘要】 
       目的研究浒苔水溶性多糖的分离提取、组成及生物活性。方法经水煮、醇析、真空干燥得到浒苔粗多糖，由苯酚-硫酸比色法测定其中水溶性多糖含量;用气相色谱-质谱法和红外光谱对其化学成分进行分析。以抗坏血酸作为对照品，同时采用生物化学法测定了浒苔多糖对羟基自由基和超氧阴离子等自由基的清除能力。结果浒苔粗多糖提取率为10.25%，其中水溶性多糖含量为86.1%。浒苔水溶性多糖为硫酸多糖，对羟基自由基和超氧阴离子具有良好的清除能力，且大小与多糖的用量呈正相相关性，且比抗坏血酸的活性强。结论浒苔多糖为硫酸杂多糖，具有显著的清除自由基的能力。
       【关键词】  浒苔;硫酸多糖;生物活性;气相色谱-质谱
       Abstract：ObjectiveTo study the isolation， purification， composition and biological activity of water-soluble polysaccharide from enteromorpha prolifera.MethodsCrude polysaccharide from enteromorpha prolifera was obtained by extracting with hot water and precipitating with ethanol. Water-soluble polysaccharides content was determined by phenol-vitriolic colorimetry. The chemical compositions of the product were examined by the gas chromatography-mass spectrometric and infrared spectrum. Meanwhile， the scavenging effects of the prepared polysaccharides on hydroxyl radical and superoxide radical were measured by biochemical method with ascorbic acid as a control.ResultsThe extraction percentage of crude polysaccharide was 10.25% with 86.1% of water-soluble polysaccharide. The main components of the cude polysaccharide were sulfated polysaccharides. The scavenging effects of sulfated polysaccharides on ·OH and O2- · were significant and concentration dependent， better than ascorbic acid.ConclusionPolysaccharide from enteromorpha prolifera is sulfated heteropolysaccharide， and its biological activity is significant.
       Key words： Enteromorpha prolifera; Sulfated polysaccharides; Biological activity; Gas chromatography-mass spectrometry
       浒苔俗称苔条、青海苔等，是一种大型绿藻，为绿藻门石莼目石莼科浒苔属的藻类植物。作为近海滩涂中的天然野生绿藻，其自然繁殖能力特别强，产量巨大[1]。我国海域浒苔资源十分丰富，很受人们欢迎，条浒苔(浒苔一种)是沿海人民常采持食用或用作饲料的藻类。浒苔富含叶绿素、碳水化合物、蛋白质、膳食纤维、矿物质、维生素和脂肪，能量却很低，是一种不可多得的天然理想营养食品原料[1，2]。海藻水溶性多糖的主要成分是硫酸多糖。硫酸多糖是多糖分子链中单糖分子的部分羟基被硫酸根取代而形成的一类多功能活性物质，可以通过物理化学方法从海藻中提取出来[3]。海藻硫酸多糖糖基单体及硫酸基的位置和其来源密切相关。研究表明，硫酸多糖水溶性好，具有显著的抗肿瘤病毒、降血脂、降血糖以及增强机体免疫机能等生物学活性，已成为研究的热点[4，5]。本研究以青岛奥帆赛前爆发的大面积浒苔为原料，从中提取了水溶性粗多糖，并研究了浒苔水溶性多糖的组成及抗氧化活性，为我们进一步开发利用浒苔提供理论依据。
       1仪器与材料
       1.1仪器UNICO 2000可见分光光度计(上海肯强仪器有限公司);KQ-400KDE型高功率数控超声波仪(昆山市超声仪器有限公司);R201型旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);FA1104型电子天平(上海精天电子仪器厂);THZ-8 恒温水浴锅(中国浙江嘉兴电热仪器厂);milli-Q(18.2 MΩ·cm) 超纯水处理系统(美国Millipore 公司);Agilent 5793I-6890气相色谱-质谱联用仪(GC-MS) 。
       1.2材料乙醇、葡萄糖、苯酚、硫酸、邻二氮菲、邻苯三酚、抗坏血酸(Vc)、乙酸酐、吡啶均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司;三氟乙酸(Tri-fluoroacetic acid，TFA)和正己烷为色谱纯，购自Dima公司;新配制的pH=7.4磷酸缓冲溶液和pH=8.2 Tris-HCl缓冲液;水为自制Milli-Q超纯水(电阻率大于18 MΩ·cm)。
       2方法
       2.1浒苔采集及前处理实验中，浒苔采自青岛石老人海水浴场，洗净泥沙及其它杂质，自然阴干，粉碎至长度小于1 cm。
       2.2浒苔粗多糖的提取[6， 7]精确取浒苔样品5 g，100 ml 95%乙醇回流提取2 h，过滤，重复3次，除去小分子物质。滤渣用水冲洗若干遍，直到滤液与苯酚-硫酸反应基本为无色。以浒苔滤渣与水的质量比为1∶50加入0.05 mol/L的稀盐酸水溶液，回流提取2 h，过滤，滤渣重复提取3次。合并滤液，浓缩至液体微黏，加入3倍体积的无水乙醇，4 °C静置过夜，离心(3 000 r/min)。沉淀依次用85%和95%无水乙醇及乙醚脱水，P2O5真空干燥过夜，得粗多糖EP 512.5 mg。
       2.3浒苔硫酸多糖的分析
       2.3.1总糖分析[8]配制50 μg/ml葡萄糖标准液，精确吸取此溶液0.00，0.40，0.80，1.20，1.60，2.00 ml分别置于10 ml容量瓶中。补加超纯水至4.00 ml，加入1.00 ml 5%苯酚摇匀，再迅速加入5.00 ml浓硫酸，摇匀冷至室温，于490 nm处测定吸光度A，绘制葡萄糖标准工作曲线。准确称取5.0 mg粗多糖，溶解过滤并定容至100 ml。取2.00 ml该溶液，按上述方法测定A值，然后根据公式，计算出样品浓度，求得粗糖中硫酸多糖含量。
       2.3.2浒苔多糖的单糖组分气相色谱-质谱测定供试品溶液的制备[9]：称取10 mg浒苔粗多糖样品溶于2 ml 的2mol/LTFA中，封管，于100℃水解6 h，最后减压旋蒸除尽TFA。在水解产物中加入0.5 ml吡啶和1 ml乙酸酐，100 °C反应6 h，得到单糖衍生物。冷却后加入水和正己烷(V/V=1∶3)，充分振荡，分层。气相色谱质谱测定：吸取上层液进行气相色谱-质谱分析[10]，记录色谱图。色谱条件:Hp-5MS毛细管柱，气化室温度260℃，不分流，采用恒流模式载气He，流量1.0 ml/min，进样量1 μl，程序升温：起始温度100℃保持6 min，以20℃/min升至220 ℃保持14 min，以5℃/min升至290℃。质谱条件：四级杆150℃，离子源200℃。
       2.3.3硫酸基团分析 采用红外光谱分析法。样品用KBr压片法制备，利用红外光谱在400~4 000 cm-1扫描检测，测定浒苔多糖的红外图谱。
       2.4浒苔硫酸多糖生物活性
       2.4.1清除羟自由基能力的测定[11]采用铁氧化邻二氮菲法。在10 ml具塞试管中加入2.3 ml邻二氮菲(0.75 mmol/L)、0.5 ml磷酸缓冲溶液(150 mmol/L，pH=7.4)、0.9 ml FeSO4(0.75 mmol/L)和0.4 ml不同浓度样品溶液。随后加入0.9 ml质量分数3% H2O2启动反应，于37 ℃恒温水浴中放置1 h。测定在510 nm处的吸光度值，并计算清除率：S=(A2-A0)/(A1-A0)×100%式中，A0为不含样品，但含有H2O2的吸光度值;A1为以高纯水代替H2O2，不含样品的吸光度值;A2为含有样品的吸光度值。
       2.4.2清除超氧阴离子自由基能力的测定采用邻苯三酚自氧化法[12]。取4.50 ml 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8. 2)，依次加入1. 00 ml样品溶液，2.4 ml水，混匀，25 °C下保温10 min后加入100 μl 8 mmol/L邻苯三酚，计时，摇匀，反应3 min后，加入50 μl 50 mmol/L抗坏血酸溶液终止反应，测定325 nm处吸光度。清除率=(As - Ac)×100%/ AsAc：含有待测物的反应液于325 nm的吸光度值As：不含有待测物的反应液于325 nm的吸光度值
       3结果与讨论
       3.1浒苔水溶性多糖提取与分析本实验采用热水浸提浒苔多糖操作简便快速，所用试剂易得且成本低，多糖得率高，纯度好，符合实验研究和大规模生产的需要。
       3.2浒苔水溶性多糖分析
       3.2.1浒苔水溶性多糖含量采用简单、快速的苯酚-硫酸比色法。多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应。生成橙色物质，在波长490 nm处和一定浓度范围内，其吸光度A值与糖浓度C呈线性关系，从而可用比色法测定其含量[13]。由吸光度A对浓度C作图，得标准曲线Y= 0.042 6X-0.010 9(R2=0.990 5)，结果见图1。按上述方法，测得其中水溶性多糖含量为86.1%。图1葡萄糖的标准曲线
       3.2.2气相色谱-质谱分析为了便于气相色谱分析，本实验采取了两点措施：一是采用乙酰化的方法进行衍生化处理，对浒苔多糖水解单糖进行乙酰衍生化，使之易于气化;二是采用水和正己烷处理衍生化的样品，吡啶和未反应的醋酸酐进入水中，解决吡啶不易旋蒸分离的难题;单糖衍生物进入正己烷，便于气相检测。1-鼠李糖2-葡萄糖3-木糖4-半乳糖5-甘露糖图2浒苔多糖水解单糖的乙酰化衍生物气相色谱图浒苔多糖水解单糖的乙酰化衍生物的气相色谱图见图2。通过各峰标准质谱尼斯特谱库(NIST)对照分析可以确定浒苔多糖为杂多糖，主要含有鼠李糖、葡萄糖、木糖、半乳糖和甘露糖。
       3.2.3浒苔多糖红外光谱分析浒苔粗多糖的红外吸收光谱(见图3)。在3 600~3 200 cm-1 的吸收带为多糖-OH基的伸缩振动引起，2 920 cm-1吸收峰为C-H的伸缩振动，1 400~1 000 cm-1 处有C-H的弯曲振动峰以及C-O和C-C振动吸收峰，以上均为多糖的特征吸收峰。此外847.8 cm-1和770.3 cm-1附近的吸收峰是硫酸基的吸收信号，说明从浒苔中提取的浒苔多糖成分主要为硫酸多糖。
       3.3生物活性研究
       3.3.1对羟自由基(·OH)的清除作用H2O2/Fe2+通过Fenton反应产生·OH，·OH将邻二氮菲-Fe2+溶液被氧化成邻二氮菲-Fe3+。邻二氮菲-Fe2+(橙红色)的褪色程度可用来衡量·OH的清除量[14]。实验证明，多糖对羟自由基(·OH)有明显的清除作用，如图4所示。浒苔多糖存在时，氧化过程受到抑制，随着样品中多糖含量的增多，清除能力逐渐增强。在实验中，当多糖浓度为0.08 mg/ml时，·OH的清除率达到30%，而据郭春梅等[11]研究表明，同样条件下，Vc的浓度高达3.6 mg/ml对·OH的清除率才达到30%。这说明硫酸多糖对·OH的清除能力比较远大于Vc。图3多糖红外光谱图图4多糖对羟自由基(·OH)的清除作用
       3.3.2对超氧阴离子(O2-·)的清除作用邻苯三酚在碱性条件下自氧化，释放出O2-·，生成有色的中间产物，可用分光光度法进行测定。当有清除剂存在时，清除O2-· ，从而阻止中间产物的积累，使邻苯三酚自氧化速率降低，表现为体系的吸光度降低[15]。浒苔多糖对超氧阴离子自由基(O2-·)清除作用如图5所示，可以看出对羟自由基的清除能力比较强。在浓度为0.012 5 mg/ml左右，超氧阴离子的消除率为49.3 %。而据文献报道[16]，Vc的浓度为0.35 mg/ml时对超氧阴离子的消除率达到50%。图 5多糖对超氧阴离子自由基(O2-·)的清除作用
       4结论
       本实验以浒苔为材料，经水煮、醇析、真空干燥得到的浒苔粗多糖为白色粉末，硫酸根的定性检测表明，该浒苔多糖为硫酸多糖，气相色谱-质谱分析结果显示浒苔多糖为杂多糖。对浒苔多糖的抗氧化性研究明浒苔多糖能有效清除多种自由基，这就为我们进一步开发利用浒苔提供了理论依据。
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