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       【摘要】 
       目的观察紫杉醇对人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293的毒性作用，及加入改构型酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)后对紫杉醇引起的肝肾细胞损害的保护，并探讨其可能机制。方法用紫杉醇诱导人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293损伤，同时加入aFGF对肝、肾细胞进行保护，并测定培养上清液中的SOD，MDA，LDH值，MTT法测定肝、肾细胞活性。结果紫杉醇在体外对人胚肝细胞L-O2、人胚肾细胞293有一定的毒性作用，使用aFGF对肝、肾细胞进行保护后，IC50值有明显的提高，SOD值与未加aFGF组相比明显升高，而MDA，LDH值明显降低(P<0.05)。结论 aFGF可有效对抗紫杉醇引起的肝、肾细胞损伤。
       【关键词】  改构型酸性成纤维细胞生长因子;紫杉醇;人胚肝细胞L-O2;人胚肾细胞293;保护作用
       Abstract：ObjectiveTo investigate the protective effects of aFGF on paclitaxel-induced nephrotoxicity in human liver cell L-O2 and human kidney cell 293 and its possible mechanism.MethodsThe effect of aFGF on paclitaxel-induced nephrotoxicity was evaluated by MTT assay. The contents of SOD,MDA and LDH in cultural supernatant were determined by general methods.Results Paclitaxel could inhibit the proliferation of human liver cell L-O2 and human kidney cell 293 in a dose-dependent manner. aFGF could protect human liver cell L-O2 and human kidney cell 293 injury induced by paclitaxel(P<0.05).ConclusionPaclitaxel has the function of inhibiting proliferation on human liver cell L-02 and aFGF can exert obvious protective effects on the cells.
       Key words： AFGF ;Paclitaxel;Human liver cell L-O2;Human kidney cell 293;Protective effect
       紫杉醇是由红豆杉树皮中提取具紫杉烷骨架的二萜类化合物，主要来源于植物，其脂溶性高，水溶性差，制成油剂抗癌活性高，对乳腺癌、卵巢癌有突出疗效[1，2]。紫杉醇注射液在抗癌药物中是一个作用机制非常独特的药物，通过诱导和促使微管蛋白聚合成微管的解聚，从而导致微管束的排列异常，形成星状体，使细胞在有丝分裂时不能形成正常的有丝分裂纺锤体，抑制了细胞的分裂和繁殖，导致癌细胞死亡。据报道在治疗量时，紫杉醇的不良反应主要报道为胃肠道反应，白细胞下降等，一般来说，抗肿瘤作用强的药物毒性也大，但对于紫杉醇在体外的肝、肾毒性如何，未见有文献报道。本实验考察了紫杉醇在体外对人胚肝细胞L-O2及人胚肾细胞293的毒性作用，及加入改构型酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)后对紫杉醇引起的肝肾细胞损害的保护，并探讨其可能机制。
       1材料与仪器
       1.1试剂人胚肝细胞L-O2、人胚肾细胞293(南京凯基生物科技发展有限公司);aFGF(广西医科大学基础实验室提供，含量为0.52 μg/ml);紫杉醇(哈尔滨三联药业有限公司，批号200806033); MTT(Sigma公司);DMSO(Sigma公司);RPMI-1640培养基(美国GIBCOBRL公司);DMEM(美国GIBCOBRL公司);胎生牛血清(杭州四季青生物材料研究所);胰蛋白酶(美国Amresco公司);谷氨酰胺(美国Amresco公司);PBS(美国Amresco公司);HEPES(Sigma公司);LDH、MDA、 SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
       1.2仪器二氧化碳培养箱(美国Forma Scientific公司);倒置显微镜(日本Olympus公司);酶标仪(芬兰thermo公司);超低温冰箱(日本三洋公司);96孔培养板(美国BIO-RAD公司);6孔培养板(美国BIO-RAD公司);超净工作台(苏州净化设备厂);台式离心机(上海安亭科学仪器厂);电子天平(上海天平仪器厂);电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂);722S紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。
       2方法
       2.1细胞培养人胚肝L-O2细胞和人胚肾细胞293的培养分别采用RPMI-1640和DMEM培养基加10%灭活FBS于5% CO2，37℃培养箱饱和湿度培养，2 d换液1次。实验中所用细胞均处于对数生长期，活细胞数大于95%。
       2.2紫杉醇的配置精密称定紫杉醇标准品适量用DMSO溶解后，用无血清培养液依次稀释，配置成30，15，7.5，3.25，1.625 μg/ml浓度梯度的紫杉醇系列浓度样品，置于4℃冰箱中保存备用。
       2.3MTT法测定紫杉醇的肝肾毒性及aFGF对肝肾的保护作用取对数生长期的人胚肝细胞L-O2和人胚肾细胞293用胰酶消化后，分别用RPMI-1640和DMEM培养液吹打制成细胞悬液分别加入96孔培养板，每孔190 μl，在5%CO2，37℃培养箱培养24 h待细胞完全贴壁后，实验孔加入不同浓度紫杉醇标准液10 μl每个浓度设12个复孔，其中6孔每孔同时加入0.52 μg/ml 的aFGF 10 μl，阴性对照孔3孔，加入含0.5%DMSO的无血清培养基10 μl，空白对照孔3孔加入200 μl的含药无血清培养基，培养箱孵育20，44 h，加入5 mg/ml的MTT 10 μl，继续在培养箱培养4 h，取出96孔板顷去上清液，加入DMSO每孔150 μl，在摇床上振动摇匀10 min，在酶标仪570 nm和630 nm的波长下测得各孔OD值。按下式计算紫杉醇对人胚肝细胞L-O2和人胚肾细胞293的抑制率。抑制率(%)=对照组OD值-实验组OD值对照组OD组×100%实验重复3次，计算平均抑制率及IC50值。
       2.4紫外分光光度法测定紫杉醇的肝肾毒性及aFGF对肝肾的保护作用取对数生长期的人胚肝细胞L-O2和人正常胚肾细胞293用胰酶消化后，分别用RPMI-1640或DMEM培养液吹打制成细胞悬液加入6孔培养板，每孔1.9 ml，在5%CO2，37℃培养箱培养24 h待细胞完全贴壁后，实验孔加入7.5 μg/ml紫杉醇0.1 ml，对照孔除加入紫杉醇外另外加入0.52 μg/ml aFGF 0.1 ml，另设空白对照组。在药物作用的12，24，48 h后，取培养液的上清液按SOD，MDA，LDH试剂盒中方法进行SOD，MDA，LDH的测定。
       2.5统计学软件处理数据数据以 ±s表示，采用SPSS13.0软件进行处理。采用Bliss法求算IC50值。
       3结果
       3.1MTT测定结果在1.625~30 μg/ml浓度范围内，紫杉醇作用后的人胚肝细胞L-O2和人胚肾细胞293的百分抑制率值随紫杉醇浓度的增加而增加，呈现线性关系。说明紫杉醇具有一定的肝肾毒性。加入aFGF进行细胞保护后紫杉醇的IC50值显著提高。结果见表1~2。表1紫杉醇的肝毒性测定及aFGF的保护作用表2紫杉醇的肾毒性测定及aFGF的保护作用
       3.2紫外分光光度法测定aFGF对肝肾的保护作用结果 aFGF可以有效抑制紫杉醇引起的肝肾细胞损伤，实验组与对照组的SOD，MDA，LDH结果有显著性差异(P<0.05)。结果见表3。表3aFGF对抗肿瘤药物引起人肝L-02损伤的保护作用
       4讨论
       aFGF是纤维原细胞生长因子家族中的一员，有许多功能。如调节细胞增殖、移行、分化和生存等[3，4]。aFGF主要作用于中胚层和神经外胚层来源的组织细胞表面，其生理功能与机体的器官和组织的形态发生、血管新生、创伤修复等有关[5，6]。它能促进有丝分裂，等电点为5~7，相对分子量为16.5×103，大约由154个氨基酸组成[7]。由于野生型aFGF的促分裂活性与细胞增殖、分化以及肿瘤发生可能存在一定的联系，因而在大规模应用时受到一定限制。通过基因工程技术，将野生型aFGF进行改构，能产生一种突变体aFGF，该突变体aFGF失去了促分裂效应，但仍保留非促分裂因子样活性。改构型aFGF去掉了促分裂活性，减少了人们对临床应用aFGF诱发肿瘤形成的担心。据报道aFGF对顺铂诱导的肾损害有一定的保护作用[8]，但其对紫杉醇诱导的肝肾细胞损伤的保护作用如何，未见有文献报道。本文采用人胚肝细胞L-O2和人正常胚肾细胞293体外培养，在细胞水平研究aFGF对肝肾细胞损伤的保护作用。
       SOD值降低表示细胞被损伤越严重。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成过氧化物。测试MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。MDA越大表示细胞受损越严重，实验结果证实随药物作用时间的延长，MDA增大，即肝、肾细胞受损越严重，亦说明紫杉醇的肝、肾毒性随时间的延长而增加。通过直接比较每组培养孔 LDH 的活性来判断药物的细胞毒性，细胞培养液中LDH 活性越高，表示药物细胞毒性越大，细胞膜通透性越高，细胞受损伤越严重。实验结果证实随药物作用时间的延长，药物对肝肾的毒性越大。加入aFGF对肝、肾细胞进行保护后SOD值与未加组相比有明显升高，MDA，LDH的值与未加组相比有明显下降。
       本实验研究结果表明，aFGF对抗肿瘤药物引起的肝肾细胞损伤具有一定的保护作用。
       【参考文献】
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