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       【摘要】 
       目的研究芒果苷对人髓系白血病HL-60细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法用MTT法观察芒果苷对HL-60 细胞增殖的影响;应用细胞形态学、DNA 凝胶电泳和流式细胞术等观察芒果苷对HL-60细胞的诱导凋亡作用;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 检测芒果苷作用前后Bcl-2、survivin基因mRNA 表达水平的变化。结果芒果苷能明显抑制HL-60细胞的增殖，并能有效诱导HL-60细胞凋亡，随着药物浓度增加和作用时间延长，其抑制作用增强、凋亡率也逐渐上升，呈剂量和时间依赖性;芒果苷作用HL-60细胞后Bcl-2、survivin基因mRNA表达随着药物浓度增加和作用时间的延长而逐渐减弱。结论芒果苷能有效抑制HL-60细胞增殖，诱导其凋亡;Bcl-2、survivin可能参与了芒果苷抑制HL-60细胞增殖、诱导凋亡的过程。
       【关键词】  芒果苷;白血病HL-60细胞;增殖抑制;细胞凋亡
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Mangiferin on proliferation and apoptoris of human acute myeloid leukemia cell line HL-60 and its mechanism.MethodsHL-60 cell was exposed to various dosages of Mangiferin. Proliferation inhibition was detected by MTT assay, the induced apoptosis was detected by cell morphology,DNA gelelectro phoresis and flow cytometry. The expression of bcl-2，survivin gene was detected by RT-PCR.ResultsThe results showed that Mangiferin remarkably inhibited HL-60 cells proliferation in a time-concentration manner. Apoptosis in HL-60 cells could be efficiently induced by Mangiferin in a time- concentration manner. The results of RT-PCR showed that the expression of bcl-2，survivin was decreased after Mangiferin treatment.　　ConclusionMangiferin can efficiently induce the growth inhibition and apoptosis in HL-60 cells,and bcl-2 and survivin may be involved in this process.
       Key words： Mangiferin;HL-60 cells;Proliferation;Inhibition;Apoptosis
       由于化疗药物的毒副作用和白血病的耐药性，联合化疗治疗白血病的效果已经达到了一个平台期。因此，研究开发针对白血病细胞的特异性靶点的高效低毒的新药已成为白血病治疗新的研究方向。芒果苷(mangiferin)是一种四羟基吡酮的碳糖苷，属双苯吡酮类黄酮类化合物，在多种植物中存在。现代药理和临床研究表明，芒果苷具有抗氧化、抗细菌、抗病毒、免疫调节、抗肿瘤等多方面的生理活性和药理作用，特别是其抗肿瘤的作用越来越受到人们重视[1]。已有实验证明，芒果苷对肿瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用[2]。本实验以人急性髓细胞白血病HL-60细胞为研究对象，观察芒果苷对HL-60细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用，为寻找研发新的白血病治疗药物提供初步的实验依据。
       1材料
       1.1药物芒果苷由广西民族医院临床医学研究所中心实验室黄华博士惠赠。用2%NaHCO3 配置成10 mmol/L，分装，-20℃冻存。
       1.2试剂IMDM培养基(美国Sigma公司)，MTT (Sigma公司)，细胞凋亡流式检测试剂盒 (BD公司产品)。逆转录酶MMLV、Taq酶、dNTP、oligo均购自Promega公司。
       1.3细胞培养人急性髓细胞白血病细胞株(HL-60细胞株)购自上海生命科学研究院细胞库，细胞悬浮生长于含20%胎牛血清的IMDM培养液中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的温箱中培养。2~3 d换1次培养液。采用台盼蓝染色计数法测定细胞存活率。取对数生长期的细胞用于以下各项实验。
       2方法
       2.1分组取对数生长期细胞用于实验。细胞初始浓度为5×104/ml，设空白对照组，实验组(20，40，80，160，200，250 μmol/ L芒果苷)分别作用HL-60 细胞24，48，72和96 h。
       2.1.1细胞毒性实验(MTT法)每组设4个复孔，培养24，48，72，96 h后，加入MTT 10 μl，静置4 h后离心弃去上清液，每孔加入DMSO150 μl，待结晶溶解。10 min后，用BIO-RAD型450酶联免疫检测仪于490波长处测OD值，计算抑制率，实验重复3次。抑制率(%)=(对照组A490-实验组A490)/对照组A490×100%
       2.1.2光镜和透射电镜下观察细胞形态分别收集、洗涤实验组和对照组的细胞，取部分细胞悬液均匀涂布于载玻片上、晾干。Wright-Gimsa染液与Sorensem磷酸盐缓冲液以1∶9混合成工作液染色，光学显微镜下观察细胞形态。其余细胞用2.5% 戊二醛对细胞进行固定，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋，制备超薄切片，醋酸铀、硝酸铅双层染色，透射电镜下观察。
       2.1.3 DNA琼脂糖凝胶电泳收集实验组和对照组的细胞，用标准苯酚/氯/异戊醇法提取DNA，用2. 5倍体积无水乙醇沉淀DNA，用20 μl pH 7. 4TE溶解DNA，在1. 5%琼脂糖凝胶中电泳。
       2.1.4流式细胞仪计数分析检测细胞凋亡(Annexin V/PE双染法)收集细胞，用预冷的PBS洗涤之后的结合缓冲液(Binding Buffer)重悬，调节细胞浓度1×106个/ml。取100 μl细胞悬液置于5 ml流式管底部。加10 μl Annexin V标记蛋白混匀，室温避光反应15 min;再加5 μl 7-AAD混匀，室温避光反应15 min;最后向流式管中加入400 μl 的结合缓冲液，重悬后上流式细胞仪分析。100 μl细胞加入400 μl结合缓冲液混匀，为空白对照。
       2.1.5RT-PCR检测Bcl-2、survivin mRNA用Trizol RNA提取试剂盒提取总RNA,RNA定量采用紫外分光光度计,取1 μg的RNA,加逆转录酶MMLV200U,按随机六聚脱氧核苷酸引物合成法合成cDNA。Bcl-2、Survivin基因扩增的引物及内对照β-actin引物均由大连宝生物公司合成, β-actin和Bcl-2引物序列设计参照文献[3]，Survivin引物设计分别参照文献[4]，β-actin正义链：5′-GTGGGGCGCCCCAGCACCA-3′，反义链：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTC-3′扩增产物长度为548 bp;Bcl-2正义链：5′-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3′，反义链：5′-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3′，扩增产物为318 bp; Survivin的引物[4]： 正义链：5′-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3′，反义链：5′-AGCCAGTCCCCCCACAGCAT-3′，扩增产物为465 bp。Bcl-2扩增为94℃预变性5 min94℃变性40 s，72℃退火40 s，72℃延长50 s，扩增30个循环。survivin扩增为94℃预变性5 min，94℃变性40s，55℃退火50 s，72℃延伸60 s，扩增30个循环。每份样本以β-actin作为内参照。1.5%琼脂糖凝胶(含溴乙锭)100 V等压电泳观察结果，以目的基因与β-actin灰度比值作为其相对表达量。
       2.2统计学分析各实验均重复3次以上，数据以±s表示，实验组与对照组间用独立样本t检验进行显著性差异比较，多组间比较采用单因素方差分析。应用统计学软件SPSS10.0进行统计分析处理。P<0.05认为有统计学意义。
       3结果
       3.1芒果苷对HL-60细胞增殖的影响20~250 μmol/L芒果苷对HL-60细胞的增殖具有显著的抑制作用，且其抑制作用随药物浓度及时间的增加而增加(见表1)。作用72 h以后，细胞几乎停止了生长，A490OD值无明显改变。表1不同浓度芒果苷对白血病HL-60细胞增殖的影响
       3.2芒果苷对HL-60细胞凋亡的影响
       3.2.1细胞形态变化Wright-Gimsa 染色后，光学显微镜下观察，与未经芒果苷作用的对照组细胞形态(见图1)相比，经200 μmol/ L芒果苷作用48 h(见图2)和72 h(见图3)的HL-60细胞缩小，核缩小，染色质浓缩成团块状，细胞核裂解以及凋亡小体形成。透射电镜下观察，未经芒果苷作用的对照组细胞的超微结构完整(见图4)，经过200 μmol/ L芒果苷作用48 h(见图5)和72 h(见图6)后的HL-60细胞超微结构发生了明显变化。细胞体积缩小，内质网增生肥大、肿胀呈空泡状改变。染色体移位，边集，部分固缩成团，部分向核一侧固缩。还可见包有不同内容物，形态大小不一的由包膜包绕的凋亡小体。
       3.2.2DNA电泳检测经20～200 μmol/L芒果苷作用48 h后，HL-60细胞可见典型的“DNA 梯形条带”，并随芒果苷作用浓度的递增而趋明显。未经处理的细胞无凋亡，DNA未被降解，电泳形成单一的条带位于点样孔附近。见图7。
       3.2.3细胞凋亡率各处理组细胞凋亡率随芒果苷浓度增高而递增。见表2及图8~9。在200μmol/ L芒果苷作用下，不同时间处理组细胞凋亡率随处理时间的延长而增高。见表3及图10~11。图1未经芒果苷处理的图2200μmol/ L芒果苷作用HL-60细胞(100×)48h后的HL-60细胞(100×)图3200 μmol/ L芒果苷作用72 h图4未经芒果苷处理的后的HL-60细胞(100×)HL-60细胞(5 900×)图5200 μmol/ L芒果苷图6200 μmol/ L芒果苷作用48h后(5 900×)作用72 h后(5 900×)图7不同浓度芒果苷作用48 h后HL-60细胞DNA电泳表2不同浓度芒果苷作用下HL-60细胞24 h的凋亡率表3200 μmol/L芒果苷作用不同时间下HL-60细胞的凋亡率图8未经芒果苷处理的图9 80 μmol/L芒果苷处理HL-60细胞24 hHL-60细胞　　图10200 μmol/L芒果苷处理图11200 μmol/L芒果苷处理24 h的HL-60细胞48 hHL-60细胞
       3.2.4Bcl-2、survivinmRNA的表达经20~250μmol/L芒果苷作用24h后，HL-60细胞Bcl-2 mRNA 和survivinm RNA的表达随药物浓度的增加逐渐明显减少;经芒果苷作用于48 h后，随作用时间的延长，Bcl-2 m RNA 和survivinmRNA的表达呈现出明显的递减趋势。见表4。表420~250 μmol·L-1芒果苷作用HL-60细胞24 h和48 h后Bcl-2、survivinm RNA的表达
       4讨论
       实验证明，很多黄酮类化合物能抑制白血病细胞增殖并具有诱导凋亡的作用。Lee等[5]发现汉黄芩素和漆树黄酮不仅能显著抑制白血病HL-60细胞增殖，并且能诱导细胞凋亡，其诱导凋亡作用呈时间剂量依赖性，并呈现典型的凋亡特征，包括DNA片断化，出现凋亡小体等。木犀草素[6]能抑制白血病HL-60细胞生长，96 h的IC50为(15±1.1)μmol/L，并能抑制白血病HL-60细胞和鼠L1210白血病细胞的N-乙酰转移酶(NAT)的活性及DNA-2氨基荧烷的合成[7]。Ko等[8]发现，从圆叶帽柱木碱果实中提取的其他3种聚甲氧基黄酮类化合物均能抑制HL-60细胞生长，并呈剂量依赖性。
       芒果苷(mangiferin)是一种四羟基吡酮的碳糖苷，属双苯吡酮类黄酮类化合物，具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等多方面的生理活性和药理作用。其抗肿瘤的作用近年来也逐渐被人们关注。Yoshimi等[9]研究发现芒果苷具有抑制由化学致癌物氧化偶氮甲烷(AOM)所诱发的F344雄性鼠结肠癌的作用。黄华艺等[2]研究发现，芒果苷能显著抑制人肝癌细胞株BEL-7404的增殖，其抑制作用呈时间和剂量依赖性。他们还进一步发现，芒果苷不但能抑制肝癌细胞增殖，还能诱导肝癌细胞凋亡，20 μmol/L芒果苷强作用BEL-7404细胞72 h后，其凋亡率达37.42%。本实验采用台盼蓝拒染法和MTT法观察到，芒果苷对HL-60细胞的生长增殖具有明显的抑制作用，且该抑制作用随药物浓度及时间的增加而增加。20，40，80，160，200 μmol/L浓度芒果苷作用HL-60细胞72 h后，其抑制率为19.03%，32.06%，45.95%，52.62%和57.86%。250 μmol/L浓度芒果苷作用于HL-60细胞24，48，72和96 h后，其抑制率分别为37.90%，54.41%，69.44%和81.33%。芒果苷作用于细胞96 h的IC50浓度为40 μmol/L。80～250 μmol/L浓度的芒果苷，作用于细胞72 h以后，细胞几乎停止了生长。采用DNA琼脂糖凝胶电泳法观察到，经20～200μmol/L 芒果苷作用48 h后，HL-60细胞可见典型的“DNA 梯形带”，并随芒果苷作用浓度的递增而趋明显。Wright-Gimsa 染色后，光学显微镜下观察可见芒果苷作用后的HL-60细胞缩小，核缩小，染色质浓缩成团块状，细胞核裂解以及凋亡小体。经透射电镜下观察芒果苷作用HL-60细胞后，超微结构发生了典型的凋亡变化。经流式细胞仪检测，200 μmol/ L芒果苷作用于HL-60细胞12，24，48 h后，凋亡率分别是10.6%，21.4% 和28.7%;20，80，200μmol/ L芒果苷作用于HL-60细胞24 h，凋亡率分别为8.93%，13.6%和21.4%。该结果表明，芒果苷对HL-60细胞的生长增殖具有显著的抑制作用，并能诱导其凋亡。
       Bcl-2是目前最受重视的细胞凋亡调控基因之一，其过度表达可抑制细胞凋亡，是肿瘤细胞耐药的主要机理。Xiao等[10]观察到，15～120 μmol/l槲皮素可诱导HL-60凋亡，15~60 μmol/L作用HL-60细胞48h后，其Bcl-2蛋白由对照组的90%表达下调到45%～84%，并能明显下调Bcl-2mRNA的表达。本研究发现，20～250 μmol/L芒果苷作用HL-60细胞24 h后，HL-60细胞Bcl-2 mRNA的表达随浓度逐渐下调，同种浓度的芒果苷分别作用HL-60细胞24及48 h后Bcl-2的表达量随时间延长亦逐渐下调，呈浓度-时间依赖性。故推测，芒果苷诱导K562细胞凋亡可能与下调Bcl-2基因的表达有关。
       Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的新成员，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，现已发现Survivin在胚胎组织中高表达，而在正常分化成熟组织中无表达，但当细胞恶变为肿瘤细胞时，Survivin将重新表达，在常见的肿瘤细胞如肺癌，胃癌，黑色素瘤，结直肠癌等，以及人类造血系统恶性肿瘤白血病细胞及其白血病细胞系如HL-60、K562等均有Survivin表达，且其表达与Bcl-2的作用无关[11~14]。Survivin已被视为肿瘤相关蛋白，参与肿瘤的发生，发展，并与肿瘤的愈后密切相关，因此，Survivin有可能作为肿瘤治疗的新靶点[15]。我们的研究发现，芒果苷作用HL-60细胞24 h后，HL-60细胞survivin mRNA的表达随浓度逐渐下调，同种浓度的芒果苷分别作用HL-60细胞24及48 h后survivin mRNA的表达量随作用时间延长亦逐渐下调，呈浓度-时间依赖性。因此，我们认为，凋亡抑制因子Survivin可能参与了芒果苷诱导HL-60细胞凋亡的过程。
       上述研究结果表明，芒果苷能显著抑制白血病HL-60细胞增殖，并能诱导细胞凋亡，机制可能与下调Bcl-2及survivin基因的表达有关，芒果苷作为一种天然的黄酮类化合物，有望成为新型的抗白血病药物，在临床治疗中发挥重要作用，但其具体的作用机制还有待于进一步全面的研究。
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