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       【摘要】 
       目的研究超声辅助提取木蝴蝶种子中总黄酮的最佳工艺条件。方法以黄芩苷为对照品，木蝴蝶总黄酮得率为考察指标，通过正交实验法优选超声提取总黄酮的最佳工艺。结果所考察因素中，木蝴蝶总黄酮的提取工艺中各因素影响程度为：超声时间(D)>超声功率(C)>料液比(B)>乙醇浓度(A)，最佳水平搭配为A1B3C2D3。结论木蝴蝶总黄酮最佳提取工艺参数为：乙醇浓度为60%，料液比： 1∶30，超声提取1次，时间50 min，超声功率： 210 W，在此条件下总黄酮提取率为23.829%。
       【关键词】  木蝴蝶;总黄酮; 超声提取
       Abstract：ObjectiveTo study the optimal extraction technical parameters of total flavonoids from Oroxylum indicum by ultrasonic-assisted extraction.　　MethodsSingle-factor analysis and orthogonal design with baicalin as a standard were used to review and optimize the extraction process according to extraction yield of total flavonoids in the same conditions.ResultsThe order of factors which affected the flavonoids extraction was time of ultrasonic treatment > ultrasound power > ratio of liquid to material > ethanol concentration, and the best match was A1B3C2D3.ConclusionThe best extraction conditions of Oroxylum indicum can be established as follows: alcohol concentration 60%, at the solid-liquid ratio of 1:30, each time 50 min for 1 time and ultrasound power 210 W, the content of total flavonoids is 23.829%.
       Key words：Oroxylum indicum;Total flavonoids;Ultrasonic extraction
       木蝴蝶为紫葳科木蝴蝶属植物木蝴蝶Oroxylum indicum(L.)Vent的成熟种子[1]。木蝴蝶化学成分以黄酮及其苷类为主，许多成分在黄芩中都已经被发现过[2,3]。该植物为一常用中药，有清肺利咽、止咳、舒肝和胃以及生肌之功能，主治以咳嗽为主症的上呼吸道感染、急性支气管炎、急性喉炎(无喉梗阻)、慢性咽炎、百日咳、肺炎后期等[4]。　目前尚未见有关木蝴蝶总黄酮提取工艺的研究报道，而用超声波法提取黄酮，是目前比较新的方法。其原理是利用超声波可使液体中产生“ 空穴作用 ”，破坏植物细胞和细胞膜结构，加速溶剂进入细胞，超声作用强化了胞内物质的释放、扩散和溶解，使其中的有效成分快速转入溶剂，使细胞内外出现浓度差，促使化学成分由高浓度溶液向低浓度溶液扩散。因此 ,超声波法大大加速了提取时间，提高了有效成分的提出率和原料的利用率[5，10]。我们研究室在植物有效成分和提取工艺方面进行了系列的研究[6],在此基础上，本文研究了超声波辅助提取木蝴蝶总黄酮的工艺，并通过正交实验进行考察，以期为工业化生产提供参考依据。
       1仪器与材料
       1.1仪器UV-2102PC型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司;KQ-300VDE型三频数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;RE-52A旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司; AR1140型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
       1.2材料与试剂木蝴蝶药材购自河南省药材公司，经刘福勤高级工程师鉴定为紫葳科植物木蝴蝶的种子;黄芩苷对照品(含量≥98%)：购自成都曼思特生物科技有限公司;其它试剂均为分析纯。
       2方法与结果
       2.1木蝴蝶总黄酮含量的测定[7]
       2.1.1标准溶液的配制和标准曲线的制作精密称取已经在60℃减压干燥至恒重的黄芩苷标准样品17.1 mg置100 ml容量瓶中，用70 %乙醇溶液定容至刻度，摇匀，即得黄芩苷对照品溶液(浓度：0.171 mg/ml)，再精密吸取黄芩苷标准品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml，分别置于50 ml容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀，以70%乙醇为空白，分别在最大吸收波长278 nm处测定其吸光度。以吸光度A为横坐标，浓度C为纵坐标绘制吸光度-浓度标准曲线，采用二元线性回归方法求出回归方程为：C=15.914A+0.1447，R2=0.999 6。
       2.1.2样品中总黄酮含量的测定[8]精密称取木蝴蝶粗粉3.0 g，置于150 ml圆底烧瓶中，加入一定量提取溶剂，提取一定时间后真空抽滤，滤液经石油醚萃取3次后减压蒸馏回收溶剂至近干，加入70 ml 70%乙醇超声溶解，移入100 ml容量瓶中，冷却至室温后用70%乙醇定容至刻度摇匀。取此样品液1.0 ml 置于50 ml 容量瓶中，加入70%乙醇定容至刻度摇匀，取此稀释液 3.0 ml于 50 ml容量瓶中加入70%乙醇定容至刻度摇匀，以70%乙醇作参比液，在278 nm 处测定吸光度，根据标准曲线回归方程计算样品溶液的总黄酮浓度。 样品中总黄酮得率按公式①计算：Y(%)=C×A×BD×10-6×100%①式中： Y―木蝴蝶总黄酮得率;A―稀释倍数;B―测定时定容量(ml);C―线性计算出的浓度(μg/ml);D―称取药材量(g)。
       2.2提取溶剂的选择精密称取上述木蝴蝶粉3.0 g，8份，置150 ml圆底烧瓶中，分别加水，70 %乙醇，95 %乙醇，甲醇60 ml各2份，分别在沸点温度下回流2 h，过滤，石油醚萃取3次至醚层无色。70 %乙醇定容至100 ml容量瓶摇匀，按“2.1.2”项操作测定吸光度，计算总黄酮得率。结果见表1。表1不同溶剂提取所得总黄酮得率的比较由表1可知70 %乙醇为提取溶剂提取效果较佳，提取率较高，且乙醇毒性小、渗透性强、易于回收、价格也较便宜，适合工业化生产。95%乙醇与甲醇的提取率相当，但甲醇毒性大且易挥发;水的极性大，易把蛋白质、糖类等溶于水的成分浸提出来，从而使提取液存放时，易腐败变质，为后续的分离带来困难。因此本实验采用70 %乙醇为提取溶剂。
       2.3提取方法的选择精密称取木蝴蝶粉3.0 g，9份，加入60ml 70%乙醇分别用索氏抽提法、回流提取法及超声辅助提取法提取，按“2.1.2”项操作测定吸光度，计算总黄酮得率。结果见表2。表2不同方法提取所得总黄酮得率的比较索氏提取法不仅提取时间长，且由于加热时间长可能导致黄酮化合物分解，提取率不高;醇回流法虽然提取率得到了提高，但时间长、能耗大;超声辅助提取法具有实验设备简单，操作方便，与常规提取法相比，提取时间短，产率高，无需加热等优点，因此，选择超声辅助提取法。
       2.4单因素实验及结果
       2.4.1乙醇浓度选择[9]在超声功率300 W，超声频率28 kHz，提取温度40℃，提取时间30 min，料液比1∶10的条件下，加入不同浓度的乙醇进行提取，按“2.1.2”项操作测定吸光度，计算总黄酮得率。结果见图1。图1乙醇浓度对总黄酮得率的影响从图1可以看出得率随乙醇浓度的增大先增大后减小，在70%左右达最大，因此乙醇浓度选择70%较合适。
       2.4.2超声频率的选择在乙醇浓度70%，超声功率300 W，提取温度40℃，提取时间30 min，料液比1∶10的条件下，不同超声频率对总黄酮得率的影响见图2。由图2可知，超声波不同的频段波长不同，影响其破碎细胞的效率，在28 kHz处其波长最适合对木蝴蝶细胞的破碎，得率最高，提取率随超声频率的增大而明显减小，所以，最佳的超声频率为28 kHz[9～11]。
       2.4.3超声功率的选择在乙醇浓度70%，超声频率28 kHz，提取温度40℃，提取时间30 min，料液比1∶10的条件下考察不同超声功率对木蝴蝶总黄酮得率的影响。结果见图3。图2超声频率对总黄酮得率的影响图3超声功率对总黄酮得率的影响由图3可知，在超声频率为28 kHz时，得率先随超声功率的增大而显著增大，达到210 W时得率随超声功率的继续增大而逐渐减小，这是因为对于一定频率和一定发生面的超声波来说，功率增大，声强随着增大。单位时间内超声产生的空化事件增多，从而有利于黄酮得率的提高。但是超声功率过大，太高的声强产生的大量空泡通过反射声波可能减少能量的传递，,超声波热效应降低，不利于提取。因此， 210 W时为最佳的超声提取功率[9～11]。
       2.4.4料液比的选择在乙醇浓度70%，超声功率210 W，超声频率28kHz，提取温度40℃，提取时间30 min条件下考察不同料液比对木蝴蝶总黄酮得率的影响。结果见图4。由图4可见，随提取溶剂量的增加提取率增大。提取过程是指被提取物在片状或颗粒状表面与溶剂反应的过程，一方面提取液比例的提高增加了料液体系间的有效成分浓度差，减少内部残留量，而且超声可以强化其水合过程 ,当提取物表面与溶剂的接触充分，空化效应形成的微射流和局部热点对物质结构的不断破坏以增加与溶剂的接触面积，从而提高了提取率。当料液比达到1∶30后，提取率变化不大，所以为得到较高的提取率且能节省溶剂，料液比应选取1∶30[9～11]。图4料液比对总黄酮得率的影响
       2.4.5提取温度的选择在乙醇浓度70%，超声功率210 W，超声频率28 kHz，提取时间30 min，料液比1∶30的条件下，考察不同提取温度对木蝴蝶总黄酮得率的影响。结果见图5。从图5中可以发现黄酮化合物提取率先随提取温度的升高而升高，温度超过40℃后基本保持不变。因此最佳提取温度为40℃[9～11]。
       2.4.6提取时间的选择在乙醇浓度70%，超声功率210 W，超声频率28 kHz，提取温度40℃，料液比1∶30的条件下，考察不同提取时间对木蝴蝶黄酮化合物提取率的影响。结果见图6。图5提取温度对总黄酮得率的影响图6超声时间对总黄酮得率的影响由图6可以看出，10～60 min内提取率呈上升趋势，提取70 min时，提取率反而下降，这是因为提取初期,固液两相有效成分浓度差大，提取率较大，随着提取时间的延长,溶剂中有效成分浓度逐渐增大，而固相中的浓度逐渐变小，也就是推动力变小，所以提取速率减缓,提取率增加不明显，直至推动力为零，提取达到平衡，再者延长提取时间的同时也增加了黄酮在空气中的氧化时间， 一些热敏性组分被破坏或超声时间过长溶剂挥发导致乙醇浓度降低，两者作用的最终结果使总黄酮得率减少，为省时节能，提取时间选择50 min[9～11]。
       2.5正交设计实验
       2.5.1正交实验[8,9]根据单因素实验结果设计了以乙醇浓度，料液比，超声功率和超声时间为自变量的4因素3水平的正交实验(见表3)，对超声提取工艺进行优化，每次实验药材量3.0 g。结果见表4～5。表3 L9(34)正交实验设计因素水平由表4～5可知，各因素对木蝴蝶总黄酮得率的影响程度不同，各因素的影响顺序为超声时间(D) >超声功率(C)>料液比(B)>乙醇浓度(A)，最终确定最佳提取条件为A1B3C2D3。即30倍量的浓度为60%的乙醇在210 W超声功率下提取50 min。
       2.5.2提取次数对提取率的影响在正交实验结果的基础上，对提取次数进行考察。称取一定量木蝴蝶粉末按最佳工艺提取3次，测得总黄酮得率分别为23.863%，0.103%，0.0213%，从省时节能考虑，提取次数选择1次。
       2.5.3优化工艺的验证实验为考察上述优选提取工艺的稳定性，按该工艺条件进行重复性试验3次，分别测定提取液吸光度，计算木蝴蝶总黄酮得率分别为23.810%，23.782%，23.895% (RSD=0.247%，n=3)，平均提取率为23.829%，优于正交实验表中的任何一组，说明该工艺稳定可行。表4正交实验数据表5方差分析结果
       3讨论
       正交实验结果表明，超声波法提取木蝴蝶总黄酮最佳提取工艺条件为：乙醇浓度60%，料液比1∶30，超声提取时间50 min，超声功率210 W，在此条件下总黄酮得率为23.829%。各因素对木蝴蝶总黄酮得率的影响程度不同顺序为：超声时间(D)>超声功率(C)>料液比(B)>乙醇浓度(A)验证实验得到的平均提取率为23.829%，优于正交实验表中的任何一组数据，说明该工艺稳定可行。该提取工艺具有稳定性好、黄酮得率高、操作简单的优点，为开发木蝴蝶总黄酮提供了良好的实验基础。
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