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       【摘要】 
       目的建立起适合阳春砂的ISSR-PCR反应体系。方法综合运用单因素实验和L9(34)正交实验两种方法，对DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等因素进行优化，以及采用温度梯度筛选引物的退火温度。结果最终获得的阳春砂的最优ISSR-PCR体系为：总体积为20 μl，其中包括10×Ex Taq Buffer(含15 mmol·L-1 Mg2+)2 μl，25 ng DNA模板，0.50 μmol·L-1引物，0.75 mmol·L-1 dNTPs和1.0 U Ex Taq酶。通过温度梯度筛选出引物UBC808的最佳退火温度为52.0 ℃。结论这一优化体系为阳春砂的ISSR分析奠定了基础。
       【关键词】  阳春砂;ISSR-PCR反应体系;单因素实验;正交实验;温度梯度
       Abstract：ObjectiveTo establish a suitable ISSR-PCR reaction system for Amomum villosum Lour.MethodsThe ISSR-PCR reaction system for Amomum villosum Lour. was optimized in four levels of four factors (DNA template, primer, dNTPs and DNA Taq polymerase) by single-factor experiment and in three levels of four factors by orthogonal experiment,and the gradient PCR was used to determine the annealing temperature of primer UBC808.　　ResultsThe proper ISSR-PCR reaction system contained 2 μl 10×Ex Taq Buffer，25 ng DNA template，0.50 μmol·L-1 primer，0.75 mmol·L-1 dNTPs and 1.0 U Ex Taq in 20 μl total reaction volume. The optimal annealing temperature was 52.0 ℃ for UBC808.ConclusionThe optimal system of ISSR-PCR reaction establishes a foundation for ISSR analysis of Amomum villosum Lour..
       Key words： Amomum villosum Lour; ISSR-PCR reaction system; Single-factor experiment; Orthogonal experiment; Temperature gradient
       简单重复序列间区(Inter-simple Sequence Repeat, ISSR)标记技术是Zietkiewicz等[1]在1994年从微卫星技术上发展起来的一种新型分子标记技术。ISSR技术结合了RAPD和SSR技术的优点，其产物多态性远比RAPD、SSR等丰富，可以提供更多关于基因组的信息，而且具有很好的稳定性和重复性[2]。目前，ISSR技术已广泛应用于物种的鉴定[3，4]、遗传多样性检测[5，6]、亲缘关系研究[7，8]以及分子标记辅助育种[9]等许多方面，并显示了独到的优势。阳春砂Amomum villosum Lour.为姜科多年生草本植物，为我国著名的“四大南药”之一——砂仁的主要来源植物。目前，铁皮石斛[10]、何首乌[11]等多种中药已建立了适合的ISSR-PCR反应体系，而阳春砂未见有ISSR-PCR体系相关的文献和报道。本研究综合运用单因素实验和正交实验两种方法，对DNA模板、引物、dNTPs、DNA Taq 聚合酶等因素进行优化，以及采用温度梯度筛选退火温度，建立起适合阳春砂的ISSR-PCR反应体系，为应用ISSR分析进行阳春砂分子鉴别和品种选育打下基础。
       1材料与试剂
       1.1材料阳春砂采自阳春市砂仁试验示范场，于2007-11引种栽培于广州中医药大学大学城校区药王山。经广州中医药大学詹若挺副教授鉴定为姜科植物阳春砂Amomun villosum Lour.。采集上述阳春砂的叶片，保存于-70℃超低温冰箱备用。
       1.2药品和试剂Tris(三羟甲基氨基甲烷)购自Saland-chem International Inc，CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和PVP(聚乙烯吡咯烷酮)购自上海伯奥生物技术公司，EDTA(乙二胺四乙酸二钠)购自天津福晨化学试剂厂，Goldview购自广州鼎国生物技术公司，PCR试剂、DNA markers购自大连宝生物技术公司。引物参照加拿大哥伦比亚大学公布的ISSR引物序列，由上海生工生物工程技术公司合成。3% CTAB提取液[12]： 3% (W/V) CTAB，100 mmol·L-1 Tris-HCl (pH8.0)，20 mmol·L-1 EDTA，1.4 mol·L-1 NaCl，1% (W/V) PVP。
       2方法
       2.1DNA提取参考段中岗等[12]的CTAB法3，并稍做改进。取0.1～0.2 g幼嫩叶片，用液氮快速研磨成粉末，迅速转入2.0 ml离心管，加入800 μl 3% CTAB 提取液，65 ℃温育30 min，间或轻摇离心管;冷却至室温，加等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，轻缓颠倒混匀，10 000 r·min-1离心15 min;取上清液约800 μl，加等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，轻缓颠倒混匀，10 000 r·min-1离心15 min;取上清液600 μl，加0.7倍体积冰冻异丙醇，-20 ℃冰箱放置2 h，10 000 r·min-1离心5 min;收集沉淀，加1 000 μl 70%乙醇清洗2次，10 000 r·min-1离心5 min，倒去乙醇，再以10 000 r·min-1离心5 min，用移液枪吸走余下的乙醇，待自然风干后加200 μl灭菌水溶解，-20 ℃保存。通过1%琼脂糖凝胶电泳及DNA/RNA Calculator检测DNA的质量及浓度，并用灭菌蒸馏水稀释至25 ng/μl。
       2.2ISSR-PCR体系优化
       2.2.1PCR扩增条件及产物检测PCR总体积为20 μl，除了表1和表3中的4种反应物，还包括10× Ex Taq Buffer(含15 mmol·L-1 Mg2+)2 μl，并用灭菌蒸馏水补足体积。经初步筛选，本实验的体系优化所用引物为UBC808，序列为(AG)8C，并根据其合成时的退火温度，初步设定扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s;相应退火温度复性40 s;72 ℃延伸90 s;35个循环后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。扩增产物取9 μl加入1 μl 10×Loading buffer混匀上样，电泳条件为：1×TAE电泳缓冲液，2%琼脂糖凝胶，120 V恒压电泳1.5 h，Goldview染色。凝胶成像系统拍照记录。
       2.2.2单因素实验根据表1中各因素的4个水平，研究各因素对ISSR-PCR体系的影响。表1阳春砂ISSR-PCR单因素实验的因素水平
       2.2.3正交实验设计选用L9(34)正交表设计针对DNA模板、引物、dNTPs、Ex Taq 酶4个因素3个水平(表2)的正交实验表(表3)。表中每个处理各进行2次重复。表2阳春砂ISSR-PCR正交实验的因素水平表3阳春砂ISSR体系L9(34)正交实验设计参照何正文等[13]的方法，对正交实验各处理的PCR扩增结果依据谱带的强弱和杂带的多少进行直观分析。条带数量丰富、清晰度高的最佳产物记为9分，与此相反，最差的记为1分。根据2次重复的分数求出每个因素同一水平下的试验值之和Ki以及每一因素水平下的数据平均值ki，并求出同一因素不同水平间平均值的极差R和方差SS。
       2.3退火温度的确定在上述试验优化的ISSR-PCR体系的基础上，对退火温度进行梯度试验，以46～56 ℃为范围，由PCR仪自动生成12个温度，筛选最优退火温度。以引物UBC808为例。
       2.4最优体系稳定性检测随机选用引物UBC835和UBC842，采用最优体系对不同DNA样品进行PCR扩增，检验该体系的稳定性。
       3结果
       3.1单因素实验
       3.1.1DNA模板浓度DNA模板浓度是影响ISSR-PCR的重要因素。DNA模板浓度过低，扩增效率低且产物稳定性差;浓度过高则会过早耗尽其他材料。因此，适量的DNA模板才能得到稳定的PCR产物。见图1，随着DNA模板浓度的增加，PCR受到抑制，导致谱带缺失。在本实验中，选用25 ng和50 ng DNA模板都能扩增出清晰明亮的条带。M-DL 2000 Markers1～4. DNA模板 25，50，75，100 ng5～8. 引物0.25，0.50，0.75，1.00 μmol·L-19～12. dNTPs 0.25，0.50，0.75，1.00 mmol·L-113～16. Ex Taq 0.25，0.50，0.75，1.00 U图1单因素实验ISSR-PCR扩增结果
       3.1.2引物浓度实验结果发现，引物浓度过低或过高都不利于PCR扩增。如图1所示，引物浓度为0.50 μmol·L-1和0.75 μmol·L-1扩增效果一致。
       3.1.3dNTPs浓度dNTPs浓度过低会影响PCR扩增的效率和产量，浓度过高则抑制反应或增多非特异性产物。从本实验结果来看，当dNTPs浓度为0.75 mmol·L-1时PCR效果较好。
       3.1.4Ex Taq DNA聚合酶用量酶是PCR扩增中的关键因素。必须有足够的酶保证其活性，以免因酶活性不足而导致PCR扩增失败或靶片段产量偏低;酶的用量过高则抑制反应或引导非特异性产物的合成。本实验设计Ex Taq酶的4个用量梯度中，0.50 U时所得到的条带最为清晰，扩增效果较好。
       3.2正交实验正交实验结果如图2。A、B 两次重复中9个处理的分数依次为：1，8，9，6，4，2，5，3，7;4，9，7，2，8，5，3，1，6，根据以上分数分别求出Ki、ki、R及SS等值(表4)。R值和SS值的大小反映了各因素对ISSR-PCR体系的影响情况，R值和SS值越大，影响越大。由表4可知，阳春砂ISSR-PCR体系中，dNTPs影响最大，而Ex Taq酶影响最小。从ki值的大小比较，也可以确定各因素的最佳水平，该值越大，相应的水平则最佳。由表4可见，DNA的水平1明显优于其他水平;引物和dNTPs的K2和K3值几乎相等，与单因素实验结果一致;Ex Taq 3个水平K值相差不大，以水平2效果稍好。因此，通过正交实验优化的各因素的最佳水平为：25 ng DNA模板，0.75 μmol·L-1引物，0.75 mmol·L-1 dNTPs和0.75 U Ex Taq酶。M-DL 2 000 Markers1～9. 表3中的处理号图2正交实验ISSR-PCR扩增结果
       3.3阳春砂ISSR-PCR最优体系的确定根据单因素实验和正交实验结果，综合比较多条引物的扩增效果，阳春砂ISSR-PCR最终优化体系确定为：总体积为20 μl，其中包括25 ng DNA模板，0.50 μmol·L-1引物，0.75 mmol·L-1 dNTPs和1.0 U Ex Taq酶。
       3.4退火温度的选择引物UBC808在不同退火温度下扩增效果如图3，温度过低则会导致小片段的丢失，且出现拖尾现象;温度过高使引物与模板不能很好地结合，造成大片段的丢失，且条带数量减少，亮度减弱。因此，引物UBC808的最佳退火温度确定为52℃。表4正交实验直观分析结果图3引物UBC808不同退火温度扩增结果
       3.5最优体系稳定性检测随机选用引物UBC835和UBC842采用最优体系分别确定了退火温度后，对不同DNA样品进行PCR扩增(见图4)，均获得稳定清晰的条带，说明该体系适合于阳春砂ISSR-PCR反应。M-DL2000 Markers1～4.UBC8355～8. UBC842图4 不同引物PCR扩增结果
       4讨论
       由于ISSR是基于PCR的一种标记技术，其不足之处就在于PCR反应条件容易受到多种因素，如模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶等的影响，需要进行PCR体系的优化。目前，对ISSR-PCR体系进行优化的主要有单因素实验和正交实验两种。单因素实验主要研究各因素对ISSR-PCR的影响情况，从而得出各因素的最佳反应条件，并将其组合即为ISSR-PCR的最优体系，但容易忽视因素之间的交互作用。正交实验则是根据统计学中的正交设计方法，综合研究各因素之间的交互作用，该法能较快地找到PCR反应的最优体系，但对结果的判断具有一定的主观性[14]。在本实验中，同时运用以上两种方法进行阳春砂的ISSR-PCR体系优化，并综合比较两种方法的结果及多条引物的扩增效果获得适合阳春砂的ISSR-PCR体系。本文的单因素实验结果发现，不同浓度的DNA模板、引物、dNTPs和Ex Taq酶对ISSR-PCR体系均有一定的影响。在正交实验中，以dNTPs影响最为显著，Ex Taq酶影响最小。两种方法优化获得的结果不尽相同，这可能与PCR的不稳定性有关，也可能与正交实验采用的直观打分方法有关。
       由于所有的热稳定Taq DNA聚合酶都需要游离的二价阳离子，通常是Mg2+的激活[15]，因此，Mg2+浓度也是影响ISSR-PCR扩增效果的重要因素之一。本实验所用的10×Ex Taq Buffer已经含有15 mmol·L-1 Mg2+，而且Mg2+浓度一般为1.5～3.0 mmol·L-1[16]，因此，在本实验中没有优化Mg2+浓度。ISSR-PCR反应优化体系建立后，PCR试剂，尤其是DNA聚合酶，应该使用同一公司的产品。不同公司产品的酶活性可能不同，从而影响反应体系的重现性。退火温度对PCR扩增效果的特异性有着很大的影响。一般来说，引物越短，PCR退火温度应越低。但退火温度过低或过高，引物与DNA模板之间的错配现象增多，导致非特异扩增上升。但不同的引物由于碱基序列的不同，都具有各自相应的退火温度，不可能找到一个适合所有引物的退火温度，因此，不同引物的退火温度仍需优化筛选，而这只要采用已建立的优化体系进行温度梯度PCR即可确定。本研究建立起了适合阳春砂的ISSR-PCR反应体系，为今后阳春砂的ISSR分析奠定了基础。
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