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       【摘要】 
       目的分析测定不同生长期瑞香狼毒和牛心朴子的总黄酮含量。方法采用分光光度法分别对不同生长期瑞香狼毒和牛心朴子的总黄酮含量进行分析测定。结果不同生长期内，瑞香狼毒和牛心朴子总黄酮含量变化趋势不同，但都是9月份总黄酮含量最高。瑞香狼毒总黄酮含量在7、8月份时明显较低，分别为6.3 mg/g和7.8 mg/g，9月份最高，达到18.5 mg/g; 牛心朴子总黄酮含量在8月份时较低，为12.5 mg/g，9月份最高，为16.3 mg/g。结论以黄酮类化合物为有效成分的瑞香狼毒和牛心朴子的最佳采收期均为9月份。
       【关键词】  不同生长期;瑞香狼毒;牛心朴子;总黄酮
       瑞香狼毒Stellera chamaejasme L.，又名断肠草、红狼毒，为瑞香科狼毒属多年生根茎型草本植物，广泛分布于东北、华北、西南、西北、内蒙古、黑龙江等地的干草原、沙质草原和典型草原的退化草地上[1]。牛心朴子Cynanchum komarovii Al.Ijirski为萝科鹅绒藤属多年生草本植物，俗称老瓜头、芦心草，主要分布于内蒙古、宁夏、甘肃、青海、陕西等地[2]。瑞香狼毒和牛心朴子均为草原退化植物，在内蒙古地区的一些退化草场，瑞香狼毒或牛心朴子大面积连片生长，已成为退化草场的建群种植物，导致草原质量和经济生产力严重下降。瑞香狼毒和牛心朴子虽然具有一定毒性，牲畜不宜采食，但二者同时又是具有不同药用价值的中草药。如瑞香狼毒具有逐水、破积、祛痰、杀虫、止痛的功能[1，3～5]，在抗肿瘤、抗菌、抗病毒(尤其是艾滋病毒)、抗癫痫等方面有独到之处[1，6]。牛心朴子具有镇痛、抗炎、抑菌功效，对呼吸系统常见病的咳、痰、喘症状可有缓解治疗作用[7～9]，此外，牛心朴子还是一种很好的蜜源植物[10]，在西北草原养蜂业中占有重要地位。黄酮类化合物是瑞香狼毒和牛心朴子的主要有效成分之一，对其在两种植物中的含量测定虽曾有报道[11～15]，但不同生长期黄酮含量的动态研究尚未见报道。为此，本文对内蒙古鄂尔多斯草原不同生长期的瑞香狼毒和牛心朴子总黄酮含量分别进行了分析测定并加以比较研究，以期为瑞香狼毒和牛心朴子的综合开发利用提供科学依据。
       1材料与仪器
       1.1材料瑞香狼毒和牛心朴子试样分别于2008-05～09每月上旬采自内蒙古自治区鄂尔多斯草原，经鄂尔多斯市林业工作站鉴定。所有实验材料取地上部分，去除花、果实，去杂，自然晾干后备用。
       1.2试剂 芦丁标准品，BR，国药集团化学试剂有限公司;95%乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、石油醚、正丁醇，AR，北京化工厂;亚硝酸钠，AR，国药集团化学试剂有限公司。
       1.3仪器SP-2000型分光光度计，上海光谱仪器有限公司。
       2方法
       2.1定性检验称取粉碎20目的瑞香狼毒和牛心朴子各5 g，分别用95%乙醇于索氏提取器中回流提取2 h，提取液浓缩近干，用30%乙醇溶解。各取溶液1 ml于试管中，加适量镁粉，再逐滴加入盐酸，两者反应均呈现桃红色，为黄酮类化合物正反应。
       2.2标准曲线的绘制精密称取120℃干燥恒重的无水芦丁(黄酮标准对照品)20 mg，用60%乙醇定容于100 ml容量瓶中，摇匀。精密量取25.0ml置于50 ml容量瓶中，加水稀释至刻度(0.1 mg芦丁/m1)。精密量取上述溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分别置于10 ml容量瓶中，分别精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3 ml，摇匀，静置6 min，加10%硝酸铝溶液0.3 ml，摇匀，再静置6 min，加1 mol/l氢氧化钠溶液4 ml，分别用30%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，静置15 min，置于比色皿中，用SP-2000型分光光度计，在510 nm波长处测定吸光度。以溶液浓度C(mg/ml)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线图，并作线性回归，求出回归方程。
       2.3样品总黄酮含量的测定精密称取粉碎20目的材料(不同生长期的瑞香狼毒及牛心朴子)各5 g，分别用95%乙醇于索氏提取器中提取，至提取液无黄酮反应为止。将提取液浓缩近干，加10 ml蒸馏水溶解后，用石油醚萃取脱脂，弃去石油醚层。水层用正丁醇萃取，至水溶液无黄酮反应为止。减压回收正丁醇至近干，加适量30%乙醇溶液溶解，分别移至50 ml容量瓶中，用30%乙醇溶液稀释至刻度。精密量取此溶液4.0 ml，分置于100 ml容量瓶中，用30%乙醇稀释至刻度。精密量取上述样品液3.0，4.0，5.0 ml，按照上述标准曲线的绘制方法，将样品溶液显色后测定吸光度，根据回归方程求出相应的浓度，用下述公式分别计算瑞香狼毒及牛心朴子的总黄酮含量：总黄酮提取率(%)=c×10×100×504m×1 000×取样毫升数×100%式中：m为样品材料粉末的重量(g);c为样品材料总黄酮的浓度(g/ml)。
       2.4稳定性实验分别取瑞香狼毒和牛心朴子样品液，在不同时间内按标准曲线方法分别测定其吸光度。
       2.5精密度实验精密吸取芦丁对照品溶液1.0ml，5份，置于10 ml容量瓶中，分别测定其吸光度。
       2.6重复性实验分别精密称取20目的样品材料5份，每份5克，按样品总黄酮含量的测定方法做平行试验，进行样品总黄酮含量的测定。
       2.7加样回收率实验精密称取粉碎20目样品材料5 g，5份，分别加一定量的标准芦丁。按样品总黄酮含量测定方法提取后测定其含量，用以下公式计算回收率：回收率(%)=混合后总黄酮量-样品总黄酮量芦丁加入量×100%
       3结果
       3.1芦丁标准曲线标准曲线如图1所示，用最小二乘法作线性回归，得芦丁的回归方程为：Y=9.531 4X-0.002 6，r=0.999 8结果表明在0～0.06 mg/ml的范围内，吸光度与浓度呈良好的线性关系。图1芦丁标准曲线
       3.2不同生长期瑞香狼毒和牛心朴子总黄酮含量的比较分析
       3.2.1瑞香狼毒总黄酮含量测定5~9月份瑞香狼毒总黄酮含量测定结果(各月份总黄酮含量均为5次平行试验的平均值)见图2所示。结果表明，不同生长期瑞香狼毒总黄酮含量不同，9月份含量最高，达1.85%(即18.5mg/g)，7、8月份含量明显较低，分别为0.63%(即6.3mg/g)和0.78%(即7.8mg/g);各月份含量高低顺序为：9月份>6月份>5月份>8月份>7月份。图2不同生长期瑞香狼毒总黄酮含量比较
       3.2.2牛心朴子总黄酮含量测定5~9月份牛心朴子总黄酮含量测定结果(各月份总黄酮含量均为5次平行试验的平均值)见图3。结果表明，整个生长期内牛心朴子总黄酮含量变化趋势与瑞香狼毒不同，但仍是9月份总黄酮含量最高，达1.63%(即16.3 mg/g)，7月份含量与9月份接近，为1.61%(即16.1 mg/g);各月份含量高低顺序为：9月份>7月份>5月份>6月份>8月份。图3不同生长期牛心朴子总黄酮含量比较
       实验结果表明，整个生长期内，瑞香狼毒和牛心朴子总黄酮含量均是9月份含量最高，说明瑞香狼毒和牛心朴子在9月份收获，其有效成分黄酮类化合物的含量较高，应具有较强的药效，若对其加以开发利用将能获得更好的利用价值。
       3.2.3稳定性实验结果瑞香狼毒和牛心朴子样品稳定性实验(以9月份样品为例)结果见图4。样品乙醇提取液加入显色剂显色后，显色溶液在40 min内稳定，40 min后吸光度明显下降。这是因为天然黄酮类化合物在结构上往往存在有多个酚羟基，在强碱性条件下，黄酮母核上的酚羟基易被氧化而褪色。故显色一定时间后，由于黄酮类化合物被氧化，致使吸光度严重下降。因此，当样品溶液加入硝酸铝显色后，应在40 min内测定吸光度，否则显色时间过长，溶液颜色变淡甚至消失，吸光度值减小至丧失。图4显色液的稳定性曲线
       3.2.4精密度实验结果见表1。由表1可知，RSD为2.85%，小于5%，表明实验结果的精密度良好。表1精密度实验结果
       3.2.5重复性实验结果见表2。表2重复性实验结果
       3.2.6加样回收率实验结果见表3。结果表明，瑞香狼毒和牛心朴子各月份平均回收率均在97%以上，且RSD值均小于5%，说明瑞香狼毒和牛心朴子试验的回收率均较高，试验相对标准偏差较小，说明应用此工艺提取、测定瑞香狼毒和牛心朴子总黄酮含量是可取的。　　表3加样回收率实验结果本研究以乙醇为溶剂用索氏提取法提取不同生长期瑞香狼毒和牛心朴子总黄酮，采用分光光度法进行含量测定。从实验的精密度、回收率、稳定性和重复性等试验数据表明，该项研究方法稳定可靠，测定数据重复可信，且操作简便易行，不仅可以用于研究瑞香狼毒和牛心朴子的总黄酮含量，也为与之相似的草本植物总黄酮含量的测定提供借鉴。
       4结论
       实验结果表明，9月份瑞香狼毒和牛心朴子的总黄酮含量均高于其他月份。黄酮类化合物是植物生长过程中产生的次生代谢产物，植物体内次生代谢产物的产生和积累与植物的生长发育程度以及外界环境因素密切相关。9月鄂尔多斯草原已是仲秋时节，植物生长进入生长末期，植物经过一个生长季的发育生长，一些次生代谢产物有了较多的积累，这可能是两种植物中黄酮类化合物含量9月份要高于其他月份的原因。所以若作为药用或者在研究和利用瑞香狼毒和牛心朴子的黄酮类化合物时，9月份是样品采集的较好时期。本实验结果为草原退化有毒植物瑞香狼毒和牛心朴子的开发和利用提供了一定的科学依据。黄酮类化合物是药用植物中主要活性成分之一，此类化合物具有多种药理作用。目前对牛心朴子的研究报道中，多为对其生物碱成分的研究。而实验研究表明，牛心朴子中总黄酮含量也较高，这为其开发利用提供了新的理论依据。瑞香狼毒和牛心朴子在我国干旱沙质草原、退化草场分布广泛，资源丰富，除具有一定的经济效益外，在沙质草原和严重退化草地上也具有一定的生态作用，应加强和完善对其各部分的科学研究，以更好地实现综合利用。
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