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       【摘要】 
       目的观察复方六月雪(CLYX)对鸭乙型肝炎所致肝损伤的保护作用，为研究和开发新的抗HBV药物提供实验依据。方法采用1日龄雏鸭接种广西麻鸭DHBV强阳性血清，13 d后用PCR法筛选出DHBV强阳性鸭。随机分成5组：CLYX高剂量组、中剂量组、低剂量组，模型组和阳性对照组，每组10只，各组雏鸭均灌胃给药14 d。于用药前(T0)、用药7 d(T7)、14 d(T14)及停药后3 d(P3)分别采血，检测血清的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性，并观察肝组织病理变化。结果CLYX中、高剂量组可显著降低ALT的活性，停药3 d后，CLYX高剂量组没有反跳现象;CLYX高剂量组可显著降低AST的活性，并在停药3 d后无反跳现象，而中、低剂量组无统计学意义。CLYX降低血清ALT和AST活性的作用有明显的量效和时效关系。同时CLYX减轻鸭肝组织病理损伤程度。结论CLYX对鸭乙型肝炎所致肝损伤具有保护作用。
       【关键词】  复方六月雪;鸭乙型肝炎病毒;肝损伤
       乙型肝炎是由HBV引起的，以肝脏炎性病变为主的一种传染性疾病。目前，中草药抗乙肝病毒已成为国内外的研究热点。六月青系爵床科(Acanthaceae)肖鸡笼属植物肖鸡笼(顶花马兰)Taraphochlamys affinis(Giff) Bremekhu的干燥地上部分[1]，为广西民间草药。它与白花蛇舌草和栀子花根等组成复方六月雪(CLYX)。CLYX是通过长时期的民间临床观察而拟定的治疗急慢性乙型肝炎的验方，具有清热解毒、利湿退黄和促进肝功能恢复之功效，临床疗效显著。实验研究发现，CLYX对四氯化碳、对乙酰氨基酚、D-半乳糖胺等所致小鼠急性化学性肝损伤均有明显的保护作用[2]。CLYX在体外对血清中HBsAg，HBeAg也有明显的抑制作用[3]。本文以广西麻鸭为研究对象，研究CLYX对鸭乙型肝炎所致肝损伤的保护作用。
       1材料与仪器
       1.1动物广西麻鸭：1日龄，雌雄不拘，体质量(50±5)g，购自广西畜牧良种养殖场。
       1.2试药CLYX：由广西医科大学药理学教研室采用全方醇水双提的最佳工艺[4]提取;阿昔洛韦(aciclovir， ACV)：湖南迪诺制药有限公司医药工业研究所产品，批号：20040829。ALT，AST改良赖式法检测试剂盒，四川省迈克科技有限责任公司产品，批号：20051109。
       1.3仪器可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品，722S。
       2方法
       2.1广西麻鸭乙肝动物模型的建立采用健康成年的广西麻鸭产的蛋孵化的1日龄雏鸭，经腹腔注射0.2 ml DHBV DNA强阳性病毒血清。接种1周后，分别从胫静脉采血约0.2～0.3 ml左右，装入一次性Eppendoff管中，整个过程注意不要交叉污染。4 000 r/min离心5 min，取血清。-20℃保存备用。采用PCR法检测筛选出感染阳性鸭。
       2.2实验分组及用药经PCR法检测筛选出感染阳性鸭，饲养至13日龄作为实验动物进行药物治疗试验。将50只鸭随机分为5组，每组10只。①模型组：等量的生理盐水;②阳性对照组：ACV，0.1 mg·kg-1·d-1;③CLYXH组：6.6 g·kg-1·d-1;④CLYXM组：3.3 g·kg-1·d-1;⑤CLYXL组：1.7 g·kg-1·d-1。另选10只健康鸭作为空白对照组。各组动物在同样条件下饲养，均以2次/d，早晚各1次，空腹灌胃给药14 d(模型组、空白对照组灌胃等量生理盐水)。于用药前(T0)、用药1周(T7)、用药2周(T14)、停药3 d(P3)时，分别从胫静脉采血，每只0.5 ml左右，分离血清，于-20℃保存备用。
       2.3血清酶活性测定采用改良赖氏法，按试剂盒所述方法操作，用分光光度计仪于505 nm波长处测吸光度值。
       2.4肝组织病理学观察于停药后3 d，各组取肝右叶同一部位1 cm×0.5 cm大小的肝组织用酒精醋酸甲醛混合溶液(AAF液)固定，石蜡包埋切片，HE染色光镜观察。
       2.5统计学处理采用SPSS11.0统计软件分析数据，治疗前后比较采用配对资料t检验，组间比较采用方差分析，各均数两两比较。
       3结果
       3.1CLYX对鸭乙型肝炎所致肝损伤鸭血清ALT活性的影响采用改良赖氏法，检测CLYX治疗前后鸭血清ALT的活性。与模型组比较，ACV组与CLYX高、中剂量组用药1周(T7)后，均可使鸭血清ALT的活性显著降低(P<0.01)，且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。停药3 d(P3)后，CLYX中、高剂量组血清ALT的活性没有反跳现象。结果见表1。表1CLYX对鸭乙型肝炎所致肝损伤鸭血清ALT活性的影响
       3.2CLYX对鸭乙型肝炎所致肝损伤鸭血清AST活性的影响采用改良赖氏法，检测CLYX治疗前后鸭血清AST的活性。与模型组比较，ACV组与CLYX高剂量组用药1周(T7)后，均可使鸭血清AST的活性显著降低(P<0.01)，且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。停药3 d(P3)后，CLYX中、高剂量组血清AST的活性没有反跳现象。结果见表2。
       3.3CLYX对鸭肝脏组织病理学的影响病毒性肝炎主要病理改变是肝细胞变性(中、重度水变性或脂肪变性)及坏死，间质性炎。结果显示，空白对照组肝细胞正常，结构基本完整(见图1);模型对照组肝细胞出现弥漫性重度脂变(见图2);CLYX高剂量组肝病变与ACV组相似，正常，结构基本完整(见图3~4)，表明CLYX有保肝作用。实验结果提示CLYX对肝组织无明显毒性作用。表2CLYX对鸭乙型肝炎所致肝损伤鸭血清AST活性的影响
       4讨论
       乙型肝炎是由HBV引起的，以肝脏炎性病变为主的一种传染性疾病。尽管已有干扰素及核苷类等各种抗病毒药物，但其疗效均不理想。目前中草药抗病毒已成为国内外的研究热点。乙型肝炎抗病毒药物的开发和评价中的重要环节之一就是建立一种方便有效的体内病毒感染模型。乙型肝炎病毒(HBV)是比较严格的嗜肝DNA病毒，其感染的宿主范围狭窄，具有明显的种属特异性，很难在普通实验动物中建立疾病模型。图1空白对照组鸭肝图2 模型对照组鸭肝组组织(HE染色，100×)织(HE染色，100×)图3ACV组鸭肝组织图4CLYX高剂量组鸭肝病理(HE染色，100×) 组织病理(HE染色，100×)1980年，Mason等[5]观察到鸭乙肝病毒直径约为40 nm，其形态与HBV相似;病毒DNA呈环状或部分单链结构，内源性DNA聚合酶可将其转变为双链环状，其DNA长度约为3 000 bp和HBV一样。病毒基因不仅在肝脏内复制，而且也可在肝外脏器，如肾、心、胰、脾等脏器中复制，这些方面均说明鸭乙肝病毒与人乙肝病毒属于同一病毒属。由于麻鸭易于孵育、饲养，容易在麻鸭等品种的雏鸭中获得实验感染成功和建立DHBV持续感染状态，从而较易建立一个与HBV感染相近似的体内实验系统。因此，鸭乙型肝炎病毒实验动物模型已被作为HBV感染的模型用于实验研究[6]。现已成为申报抗乙肝病毒新药必须做的体内实验模型。
       我们应用广西1日龄雏鸭经腹腔感染DHBV的方法来建立鸭乙型肝炎动物模型进行CLYX保肝降酶疗效的实验。研究结果表明，CLYX中、高剂量组可显著降低ALT的活性，停药3 d后，CLYX高剂量组没有反跳现象(P<0.01);CLYX高剂量组可显著降低AST的活性，并在停药3 d后无反跳现象(P<0.01)，而中、低剂量组无统计学意义。CLYX抵制血清ALT和AST的作用有明显的量效和时效关系。同时CLYX减轻鸭肝组织病理损伤程度。研究结果提示，CLYX对鸭乙型肝炎所致肝损伤具有保护作用，这可能是其治疗慢性乙型肝炎的其中一条途径。
       【参考文献】
         　[1]林兴，黄权芳，黄仁彬，等.广西民间药六月青的性状与显微鉴定[J].中药材，2005，28(7):541.
       
       [2]苏洁寒，荣延平，黄仁彬，等.复方六月雪对急性化学性肝损伤的保护作用[J].广西医科大学学报，2003，20(4):497.
       
       [3]杨霞芳，荣延平，黄仁彬，等.复方六月雪在体外对HBsAg和HBeAg的抑制作用[J].广西医科大学学报，2004，21(4):511.
       
       [4]李江，黄忠仕，黄仁彬，等.复方六月雪颗粒提取工艺研究[J].中国药房，2005，16(1):16
       
       [5] Mason W.S.，Seal G.，Summers J.Virus of Pekin Ducks with Structural and Biological Relatedness to Human Hepatitis B Virus[J].Juournal of Virology，1980，3(36):829.
       
       [6]Delmas J，Schorr O，Jamard C，et al .Inhibitory effect of adefovir on viral DNA synthesis and covalently closed circular DNA formation in duck hepatitis B virus-infected hepatocytes in vivo and in vitro[J].Anti microb Agents Che mother，2002，46(2):425.