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       【摘要】 
       目的探讨川芎嗪对阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA) 诱导的大鼠膜性肾病的防治作用和机制。方法将30只SD雄性大鼠随机分为：正常组，模型组，川芎嗪预防治疗组。除正常组外，其余两组均按改良Border(1)法复制膜性肾病大鼠模型，川芎嗪预防治疗组加用川芎嗪进行干预治疗。正式免疫第4周末取大鼠肾组织进行光镜、电镜及免疫荧光检测;取尿和血液检测尿蛋白定量，血清白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、血肌酐、尿素氮以及内生肌酐清除率的情况。结果川芎嗪组肾小球上皮下电子致密物沉积明显减少，肾脏病理损害较模型组明显减轻;川芎嗪组血肌酐、尿素氮水平与模型组比较显著降低(P<0.05),而血清白蛋白水平与模型组比较显著升高(P<0.05)，24 h尿蛋白定量、胆固醇、甘油三酯与模型组比较降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论川芎嗪可能通过减少肾小球上皮下免疫复合物的沉积、减轻足细胞损伤、抑制肾小球基底膜增厚及降低血肌酐、尿素氮水平而对肾功能起保护作用。
       【关键词】  阳离子化牛血清白蛋白;川芎嗪;膜性肾病
       膜性肾病(Membranous nephropathy，MN)是一种常见的肾小球疾病，其主要的病理改变是肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)上皮下免疫复合物沉积伴GBM弥漫性增厚，其临床表现为大量蛋白尿或者肾病综合征，常有髙凝状态存在。目前西医对MN的治疗以激素和细胞毒药物为主，辅以肝素、潘生丁抗凝、抗血小板治疗，但存在较大的副作用和疗效的不确定性[1]。川芎嗪又名四甲基吡嗪，为中医活血化瘀的代表用药川芎的有效成分提取物，具有扩张血管，改善微循环，抑制血小板聚集，抑制细胞增生，抗氧化、抗纤维化，抗细胞凋亡等药理作用，多年来广泛用于肾脏疾病的治疗并取得了较好的疗效[2]。故本实验用川芎嗪干预治疗大鼠MN，并探讨川芎嗪对大鼠MN的防治作用及其可能的作用机制。
       1 材料与方法
       1.1 药品与试剂天然牛血清白蛋白、4 mol/L醋酸缓冲液(pH=4.75)、无水乙二胺(EDA)(购自国药集团化学试剂成都有限公司)，羊毛脂、液体石蜡、碳化二亚胺(EDC)(购自厦门星隆达化学试剂公司),川芎嗪注射液(购自北京双鹤制药厂)。
       1.2 动物及分组清洁级SD大鼠30只，雄性，健康，体质量100～150 g，由泸州医学院动物中心提供;大鼠适应性喂养7 d，尿蛋白定性为阴性者纳入实验，将动物随机分为3组：正常组、模型组、川芎嗪预防治疗组,每组10只。
       1.3 C-BSA肾炎模型制作用改良Border法[3]，通过连续4周隔日尾静脉注射C-BSA(16 mg/kg)制作大鼠膜性肾病模型。自正式免疫第1周起，正常组和模型组每日腹腔注射2 ml生理盐水，川芎嗪组每天腹腔注射等体积生理盐水稀释的川芎嗪注射液(100 mg/kg)。
       1.4 观察指标正式实验第1～4周末，准确收集24 h尿检测尿蛋白量。于正式免疫第4周末处死大鼠。处死前大鼠称重，并准确收集24 h尿和血液，检测24 h尿蛋白、尿肌酐和血肌酐、尿素氮、白蛋白、胆固醇、甘油三酯,按公式计算内生肌酐清除率[4];取肾组织用4%多聚甲醛固定液及2.5%戊二醛固定液固定后，进行包埋，切片作光镜、免疫荧光及透射电镜扫描检查鉴定成模情况，观察肾脏病理学改变的情况。
       1.5 统计学处理采用SPSS14.0统计软件，数据资料皆用±s表示，组间比较采用单因素方差分析。
       2结果
       2.1 肾组织学检查光镜：在HE、PASM、Masson染色下，4周末时，正常对照组基底膜不增厚，上皮细胞形态正常，系膜细胞及基质无增殖，肾小管、肾间质无异常，PASM、Masson染色无异常。模型组大鼠肾组织肾小球肿大，球囊腔较狭窄，毛细血管血栓形成较多，Masson染色可见肾小球毛细血管壁呈均匀一致性增厚，部分上皮下可见嗜复红蛋白沉积(见图1)，PASM下可见GBM外侧可见典型的“钉状突起”，肾小球系膜细胞可见轻度增生(见图2);与模型组比较，川芎嗪组肾小球肿大，球囊腔狭窄均不明显，GBM增厚较轻，肾小球系膜细胞增生不明显。a-为正常组b-为模型组c-川芎嗪组，由图可见模型组GBM增厚明显，部分呈现“双轨征”，GBM上皮下可见嗜复红蛋白沉积，肾小球囊腔狭窄，川芎嗪组肾脏病理改变明显减轻图1各组Masson染色比较a-为正常组b-为模型组c-为川芎嗪组,由图可见模性组GBM增厚，部分可见上皮下“钉状突起”形成图2各组PASM染色比较电镜：模型组在4周末时，可见GBM增厚明显，肾小球上皮细胞肿胀，足突相互融合，部分足突变平或消失，肾小球上皮下有大量电子致密物沉积，GBM上皮侧伸出突起形成光镜下所见的钉突，部分肾小球可见钉突顶部融合，出现双层梯状结构。川芎嗪组肾小球毛细血袢开放，内皮细胞分布均匀，基底膜电子致密物沉积较少，上皮细胞肿胀不明显，足突清晰部分可见融合(见图3)。a-为正常组b-为模型组c-为川芎嗪组,由图可见模型组肾小球足突广泛融合，GBM增厚明显，肾小球上皮下大量电子致密物沉积，内皮细胞胞浆疏松，川芎嗪组肾脏病变明显减轻。　　△为沉积的电子致密物图3各组电镜下病理改变免疫荧光：模型组和川芎嗪组均可见IgG沿肾小球毛细血管壁和部分系膜呈颗粒状沉积，模型组荧光强度为“++～+++”;川芎嗪组荧光强度为“+～++”。正常组肾小球毛细血管壁未见明显荧光(见图4)。a-为正常组b-为模型组c-为川芎嗪组,由图可见模型组IgG沿肾小球毛细血管壁和部分系膜呈耀眼的颗粒状弥漫性沉积，部分因相互融合而呈斑块状，川芎嗪组IgG强度明显减弱，正常组未见明显荧光图4各组免疫荧光比较
       2.2 临床指标的检测
       2.2.1对尿蛋白的影响从实验第2周末开始，模型组及川芎嗪组24 h尿蛋白定量检测结果均较正常组显著升高(P<0.01)，川芎嗪组24 h尿蛋白定量结果较模型组减少，但差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1 。表1各组不同时间段24 h尿蛋白变化情况
       2.2.2对血肌酐、尿素氮的影响模型组血肌酐、血尿素氮结果较正常组明显增高(P<0.01);川芎嗪组血尿素氮与正常组比较稍微升高，但差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较，川芎嗪组血肌酐、血尿素氮水平明显降低(P<0.01)。结果见表2。
       2.2.3对血浆白蛋白、甘油三酯及胆固醇的影响模型组血浆白蛋白水平较正常组显著降低(P<0.01)，川芎嗪组血浆白蛋白水平与正常组比较差异无统计学意义，但与模型组比较显著升高(P<0.01)。甘油三酯及胆固醇水平各组间比较，模型组较高，而川芎嗪组较低，但均无明显差异性，无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。
       2.2.4对内生肌酐清除率的影响：与正常组比较，模型组内生肌酐清除率降低，有显著差异性(P<0.01)，川芎嗪组内生肌酐清除率稍微降低，无明显差异(P>0.05);与模型组比较，川芎嗪组内生肌酐清除率升高，有显著差异(P>0.05)。结果见表2。
       3讨论
       MN主要病理特点为：原位免疫复合物形成、足细胞损伤肿胀变形、基底膜弥漫性增厚，临床主要表现为大量蛋白尿及血液高凝状态。不论足细胞损伤肿胀变形、GBM增厚还是血液髙凝状态，均属于中医理论中的“血淤证”[5]。因此选用川芎嗪来干预治疗实验大鼠MN，探讨其防治作用和机制具理论依据和有可行性。
       MN的发病机制尚未完全清楚，但目前公认为免疫损伤是始动因素。抗原刺激免疫反应产生抗体, 抗体与足细胞足突上的抗原结合后形成上皮下的免疫复合物，激活补体产生攻膜复合物C5b-9(MAC)，导致足细胞损伤、活化，足细胞上调氧化剂、蛋白酶、类前列腺素、转化生长因子、生长因子、结缔组织生长因子的基因表达，产生过多的细胞外基质形成钉突，足细胞凋亡等，结果漏出大量蛋白尿，而大量蛋白尿又进一步加重了肾小球损害发展为肾小球硬化和肾间质纤维化，导致尿毒症[6]。
       本实验结果表明川芎嗪可以减轻MN的病理改变，延缓肾小球硬化。其具体表现为：①川芎嗪减少了肾小球上皮下免疫复合物的沉积，可能与川芎嗪具有改善微循环作用，使原位免疫复合物不易形成、沉积和便于被清除有关。②足细胞损伤减轻。足细胞损伤程度与MAC形成的量有关[7]，大剂量MAC导致足细胞溶解，而亚溶量MAC则通过复杂的作用诱导足细胞损伤。川芎嗪减少了原位免疫复合物的沉积量，因此可以减少免疫因素介导造成的足细胞和肾小球滤过膜损伤，减少尿蛋白，避免尿蛋白漏出增加对足细胞和滤过膜的进一步损伤。③GBM增厚减轻。GBM 弥漫性增厚是MN 最特征性的病理改变，GBM 增厚除免疫复合物沉积以外，主要是基膜Ⅳ型胶原、纤连蛋白和硫酸肝素糖蛋白等ECM 成分增多堆积的结果。川芎嗪减轻GBM增厚的机制可能有:①减少免疫复合物沉积;②通过影响调控ECM合成和降解的酶系或因子，从而抑制ECM 成分生成和/或增加ECM 降解等来减轻GBM增厚程度;③直接抑制肾小球固有细胞过度合成GBM的成分。后两种可能机制是我们后续实验准备进一步研究探讨的。④延缓肾小球硬化。在MN发生发展过程中，亚容量C5b-9致足细胞的损伤、活化、凋亡使足细胞脱落[8]，GBM 暴露，以及GBM增厚是导致肾小球硬化的重要发病机制[7，8]。在本实验结果提示，川芎嗪可以明显减少MN免疫复合物的沉积，减轻足细胞的损伤和GBM增厚，延缓了肾小球硬化的进程。表2正式免疫第4周末各组肾功能及血脂变化情况在膜性肾病，蛋白尿不仅是肾脏病变的结果，更是促使肾脏疾病进行性发展的重要因素，因此，控制蛋白尿是治疗肾脏疾病的关键之一，对临床上早期防治肾脏病以及延缓病程进展具有重要的意义[9]。本实验结果提示，川芎嗪可以减少MN大鼠的尿蛋白量，但与模型组比较差异无显著性。可能原因有：①MN病理改变进展到一定程度时，肾小球硬化，尿蛋白排出自然减少;②川芎嗪有减轻肾小球滤过膜损伤、延缓肾小球硬化作用，在正式实验第4周末时，川芎嗪组大鼠肾脏排出尿蛋白量比硬化明显的模型组多。因此，川芎嗪即使有明显的降尿蛋白作用，也可能出现统计无显著差异的现象。③川芎嗪在减轻GBM增厚时，是否可能使GBM的某些ECM成分分解过度，而造成尿蛋白丢失增加，还有待于进一步研究证实。
       陈辉乐[2]在综述中报道川芎嗪在临床应用中有保护肾功能作用。本实验结果也提示了相同的结论，其机制可能为：①川芎嗪减少了免疫复合物的沉积，减轻了足细胞损伤、GBM增厚和肾脏的病理改变，延缓了肾小球硬化。②川芎嗪在一定程度上减少尿蛋白滤过，减轻其对肾小球滤过膜的进一步损伤，减慢了MN的进展;③川芎嗪有抗血小板聚集作用，减少了肾小球内微血栓的形成;④川芎嗪降低血脂，有助于减轻系膜增生导致的肾小球硬化;⑤川芎嗪通过扩血管、改善肾脏微循环,提高了MN大鼠肾脏的内生肌酐清除率。
       综上所述，川芎嗪可以通过多种途径和机制减轻肾脏病理改变和保护肾功能，且其毒副作用小，药源广泛，价廉，在临床上具有广阔的运用前景。因此，进一步探索川芎嗪对MN的防治作用和机制可为活血化瘀中药治疗MN提供部分科学依据，有望为MN的治疗带来新的突破。
       【参考文献】
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