文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       综述了酶法生物转化的概况以及糖苷酶类、氧化还原酶类和其他基团水解转移酶生物转化中药有效成分的研究进展。
       【关键词】  生物转化;酶;中药;有效成分
       生物转化(biotransformation)是利用植物离体细胞或器官、动物细胞、微生物及其细胞器,以及游离酶对外源性化合物(exogenous substrate)进行结构修饰的生化反应。其本质是利用生物体系本身所产生的酶对外源化合物进行酶催化反应,它具有反应选择性强、反应条件温和、副产物少、不造成环境污染和后处理简单等特点。
       人类最早掌握和利用的生物转化技术是酿酒和制醋。在古代酒和醋也作为药物使用。1864年巴斯德发现乙酸杆菌能将乙醇氧化为乙酸，人类开始利用微生物转化的方法合成化学物质。利用山梨醇在弱氧化乙酸杆菌如A.suboxydans和A.melangenum的作用下转化成具有光学活性的L-山梨糖(L-山梨糖是维生素C合成的关键中间体)[1]，这一微生物转化方法使维生素C能够大规模工业化生产，供应临床大量应用，改变了以往人们只能用水果和蔬菜中所含的微量维生素C来治疗有关疾病的情况。近年来,随着基因工程、酶工程、细胞工程技术的不断发展和完善,使生物转化技术广泛用于天然化合物的结构修饰和合成、药物前体化合物的转化、有机化合物的不对称合成、光学活性化合物的拆分和药物代谢研究等诸多领域。下面主要综述天然药物的酶法生物转化。
       1酶法生物转化
       酶法生物转化的本质是由酶将一种物质(底物)转化为另一种物质(产物)的过程，这一过程是由一种或几种酶作为生物催化剂，进行的一种或几种化学反应，即为一种利用酶的合成技术。这些酶能够对外源添加的底物进行非天然反应(unnatural reaction)催化，因而酶生物转化被认为是有机化学的一个特殊分支[2]。中药的活性成分是中药治疗与预防疾病的物质基础，也是药物化学家寻找新的药理活性分子的重要来源。但是中药中很多高活性成分属于痕量物质，而中药有效成分的生理活性与其结构紧密相关。如果在中药提取过程中通过某些酶的加入将一些生理活性不高，或没有生理活性的高含量成分的结构转变为高活性分子结构，可以大大提高提取物的生理活性及应用价值，降低生产成本，从而促进工业化生产[3]。　近一个多世纪以来，人们已经从中药中分离纯化出数以万计的活性化合物，其中许多化合物被成功地开发成为药物。然而从中药中分离纯化出中药活性成分有许多由于含量低、药理作用不显著、毒副作用大、水溶性差等原因极大地限制了它们的广泛应用。这一点也可以利用酶法生物转化，通过改变其性质而得到改善。近年来开展的采用微生物、植物细胞和游离酶对天然化合物如人参皂苷、大豆皂苷、三七皂苷、甘草皂苷、甾体化合物等进行结构修饰的研究已取得可喜进展[4]。
       2应用酶法生物转化中药有效成分的酶
       按照催化改变中草药活性成分基团涉及的酶，可将其归纳为糖苷酶类、氧化和还原酶类、其他基团水解转移酶类等。
       2.1 糖苷酶类目前，已经发现了多种糖苷化酶(glucosdiase)。糖苷化酶催化的糖苷化反应是非常有意义的，因为它不仅可以生成新的糖苷化物，还可以将一些脂溶性物质转变为水溶性物质。不仅如此，糖苷化同时是生物体对于外源性物质的一种脱毒反应。通过糖苷化，可以降低疏水性物质对于细胞膜的刺激，从而起到自身防御作用[5]。金凤燮等[6]完成了“酶转化法生产Rh2等人参稀有皂苷”的研究。Rh2等人参稀有皂苷在红参和野山参中含量只有十万分之几，具有高抗癌和保健功能，是贵重的医药保健食品原料和化妆品添加剂。由于Rh2等人参稀有皂苷附加值高，世界各国自20世纪80年代开始努力开发，但均未实现工业化生产。金凤燮教授等人在研究中发现4种人参皂苷糖苷酶，也弄清了人参皂苷糖苷酶只有在极其恶劣的环境条件下产酶的机理，建立了酶法改变栽培参中含量较高的皂苷Rb，Rc，Re，Rd，Rgl等生产Rh2等人参稀有皂苷的方法。从人参二醇类皂苷生产Rh2等人参稀有皂苷的转化率高达60%，比从红参中提取提高500~700倍，在世界上第1个实现了Rh2等人参稀有皂苷的工业化生产。
       刘颖新等[7]通过酶法改变甘草皂苷糖基，制备出甜度达到蔗糖1 000倍的单糖甘草皂苷。其单糖甘草皂苷不仅甜度高，而且解毒保肝活性高，且克服了原甘草甜素的排钾阻钠的副作用，对医药食品意义很大。
       匡莹等[8]通过实验筛选出Absidasp.E9r菌能够高产淫羊藿苷糖苷酶，该酶对淫羊藿总苷中多糖基淫羊藿苷具有很好的水解作用。通过减少糖基的数目，将多糖基的淫羊藿苷水解成低糖基的淫羊藿苷，使其生理活性得到很大提高。
       王侃等[9]从Absida sp.R9 g菌中提纯出来的芦丁-α-鼠李糖苷酶可以将芦丁水解转化为异槲皮素，异槲皮素由于其作为抗氧化剂的特异性质，其药理活性比芦丁还要高。
       毛羽等[10]通过实验确定了黄芪皂苷糖苷酶的最适反应条件。该酶能将多糖基的黄芪皂苷水解成低糖基的皂苷。
       金东史等[11]利用人参皂苷-β-葡萄糖苷酶将人参中含量较高的皂苷-Rb、Rc和Rd等原人参二醇类皂苷转化,得到具有高抗癌活性的人参皂苷Rh2。
       王永宏等[12]筛选了一株高产β-葡萄糖苷酶的青霉菌株,对栀子进行发酵转化,发酵条件优化后β-葡萄糖苷酶酶活可达到8.2 U/ml,栀子中主要成分京尼平苷转化成药效更强的京尼平,且京尼平苷的转化率达到95%以上。
       吴秀丽等[13]发现真菌菌株EST-I与EST-II能产生特异性水解C-6位葡萄糖的β-葡萄糖苷酶可以将人参皂苷Rg1定向转化为稀有的人参皂苷F1。
       刘欣等[14]从中华白玉蜗牛消化酶中分离出的一种人参皂苷Rb1水解酶,该酶对人参皂苷Rb1C20位的一个糖苷键进行有选择的水解生成人参皂苷Rd。
       姜彬慧等[15]首次利用β-葡聚糖苷酶对三七皂苷-Fe转化得到20(S)原人参二醇-20-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→6)β-D-吡喃葡萄糖苷、20(S)原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,转化率接近95%。
       冯冰等[16]利用新月弯孢霉(3.381)在培养过程中产生的酶系对重楼皂苷Ⅴ和重楼皂苷ⅥC-3位糖链进行了选择性水解研究,结果表明新月弯孢霉均能将两者糖链末端的鼠李糖水解,得到两种单糖基甾体皂苷,转化产物分别鉴定为延龄草苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
       2.2 与活性成分提取及性质改善有关的酶葛根素是葛根中含量最为丰富的异黄酮,也是葛根的主要有效成分,其水溶性差,因此不能通过注射给药。为提高其水溶性,利用多种酶进行结构改造,发现来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的麦芽糖淀粉酶最为有效,得到两种主要产物,分别为α-D-葡萄糖基-(1→6)-葛根素和α-D-麦芽糖基-(1→6)-葛根素, 溶解度分别是葛根素的14倍和168倍[17]。
       薛慧玲等[18]用筛选获得的β-葡萄糖醛酸酶产生菌HQ-10对黄芩中的主要前体物质黄芩苷进行发酵转化,转化后黄芩素得率是原药材中的5.3倍,有效成分得到浓缩。
       许平平等[19]研究了水提法和醇提法对黄芪总皂苷的提取效果的影响,比较了AB-8大孔吸附树脂法和正丁醇萃取法对黄芪总皂苷的纯化效果的影响,在提高3个糖基黄芪皂苷的含量,再经酶转化,黄芪甲苷的得率可提高15%。
       甘草皂苷是甘草中主要的活性成分,具有多种生理活性。近年来研究发现甘草皂苷对艾滋病病毒(HIV)的增殖有显著的抑制效果,甘草皂苷在0.5 mg/ml可抑制98%以上的HIV病毒的增殖。但因其有潴钠排钾的副作用,过多服用导致人体电解质平衡失调而使临床应用受到限制。很多研究结果表明,甘草皂苷的生物活性与其β-葡萄糖醛酸基有密切的关系,去除部分糖基往往能改变或提高其生理活性。如应用黑曲霉sp.48菌株酶系可以去除甘草皂苷C3位最末端一分子的β-葡萄糖醛酸基,得到单葡萄糖醛酸基甘草皂苷(mono-β-glucuronide glycyrrhizin GAMG)[20]。具有治疗心血管、脑血管类疾病的中药红花经夏枯草芽孢杆菌S2-13全成分生物转化后,其抗氧化功效提高1.44倍。经具有高纤溶酶活性的地衣芽孢杆菌C2-13全成分生物转化后,能增强红花的溶血栓药效,血栓长度缩短55.8%[21]。
       吴少杰等[22]分别采用生物酶水解法和液体发酵转化法进行了甘草皂苷的生物转化,得到单葡萄糖醛酸基甘草皂苷元,获得产物的产率分别为23.7%和10.0%。
       李晖等[23]利用黑曲霉干粉将甘草酸转化为单葡萄糖醛酸基甘草次酸。实验中采用甲醇配制酶转化后的样品溶液，不仅改善了甘草酸的溶解性，还避免了酶转化样品中蛋白质等生物大分子的溶解。
       2.3 其他基团水解转移酶类、氧化还原酶类全波等[24]利用米曲霉对原薯蓣皂苷进行转化，结果得到了5个转化产物，包括3个呋甾皂苷和2个螺甾皂苷。米曲霉可以在保留原薯蓣皂苷的26-位葡萄糖的情况下水解3-位末端l→2鼠李糖生成次生呋甾皂苷。米曲霉也可以去掉原薯蓣皂苷的22-位羟基生成20(22)双键的呋甾皂苷产物，并且继续水解26-位葡萄糖生成相应的螺甾皂苷。
       郭永超等[25]用小克银汉霉菌对马兜铃酸A(aristolochicacid A)进行了代谢转化研究,发现微生物转化产物和哺乳动物体内的代谢产物马兜铃酸A的氧去甲基化物非常相似,小克银汉霉菌可以作为研究马兜铃酸A代谢物的一个体外模型。环氧化反应在转化的过程中也很普遍，多发生在化合物的双键部位，尤其在萜类中常见，除环氧化反应，双键部位也很容易形成邻二醇结构[26，27]。淫羊藿为常用中药,主要成分为淫羊藿苷,淫羊藿苷均有3个糖基,研究表明低糖基淫羊藿苷和淫羊藿苷元活性均明显高于淫羊藿。利用曲霉属霉菌产生的诱导酶水解淫羊藿苷可制得低糖基淫羊藿苷或淫羊藿苷元,且转化率高[28]。碳氢化合物中非活泼C—H键的羟化是一种非常重要的生物转化反应,传统有机化学合成几乎不能进行这样的直接羟化反应。微生物及其酶体系能够在甾体化合物的C1至C21和C26位进行羟基化,以提高其生物活性和制备中间体。短刺小克银汉霉Cunninghamella blakesleana AS 3.970对雷公藤甲素进行生物转化,得到7个转化产物,分别是5α-羟基雷公藤甲素、19α-羟基雷公藤甲素、19β-羟基雷公藤甲素、雷公藤乙素(2β-羟基雷公藤甲素)、16-羟基雷公藤甲素、雷醇内酯(15-羟基雷公藤甲素)和1β-羟基雷公藤甲素[29]。
       张卉等[30]使用微紫青霉对莪术醇进行了转化,发现微紫青霉将莪术醇转化为15-羟基莪术醇,转化率达到24%,且转化产物为未见文献报道的新化合物,体外试验表明其对副流感病毒、呼吸道合孢病毒和单纯疱疹病毒I型有较好的抑制作用。
       紫杉烷类骨架上的多个位置都可以被羟基化,其中1β,7β,9α,13α羟基化是合成活性紫杉烷类化合物的非常重要的反应,对这些反应进行深入研究,找到催化反应的酶,进而发现编码酶的基因,将有助于生物合成途径的研究。羟基化反应亦可发生在紫杉烷的环状骨架以外,如:17位、20位、1位酰基侧链以及3′-苯基对位的羟基化反应[31]。2006年,美国学者[32]在Nature上发表了一篇有关生物转化方面的研究论文。利用工程菌将amorpha-4,11-diene定向转化为artemisinic acid,而后者是合成青蒿素的重要前体化合物。该研究方向主要集中在对于生物催化关键酶的深入研究其中包括酶纯化技术、非水体系生物转化技术、细胞固定化技术、基因工程技术等。迄今已有多种催化一些重要反应的酶被分离出来,如用于合成异羟基洋地黄毒苷(digoxin)的洋地黄毒苷12β-羟基化酶,用于将莨菪碱(hyoscyamine)转化为东莨菪碱(scopolamine)的莨菪碱6β-羟基化酶[33]等。结合基因工程技术,还可以实现这些酶的大量体外表达,从而直接将生物转化技术应用于工业生产[34，35]。
       3小结
       酶法生物转化在中药有效成分结构的改变和性质的改善方面的应用，是利用了酶促反应的专属性和高效率。将廉价的中药原料中的低活性化学成分转化为高活性化学成分，并通过结构的改变，使性质改变为有利于生物体吸收利用。此方面的研究，对开发具有我国自主知识产权的天然药物，有着非常的积极意义和无限的发展潜力。这方面的研究必将会有不断更新和更重要的进展，有待于我们关注。
       【参考文献】
         　[1]吴梧桐.生物制药工艺学[M].北京.中国医药工业出版社，1993:423.
       
       [2]卢艳花.天然药物的生物转化[M].北京：化学工业出版社，2006:90.
       
       [3]许明淑，罗明芳，邢新会，等.酶法强化中药提取的研究进展[J].中国中医药信息杂志，2005，12(12)：37.
       
       [4]马骁驰，果德安.中药活性成分生物转化的研究思路与方法[J].中国天然药物,2007,5(3):162.
       
       [5]马晓驰.三种活性倍半菇类化合物的生物转化研究[D].沈阳药科大学博士学位论文，2005:9.
       
       [6]金凤燮，鱼红闪，卢明春，等.人参皂苷实现工业化生产[J].中国中医药信息杂志，2004，11(4)：367.
       
       [7]刘颖新，范业雪.酶技术在中药有效成分提取与转化中的研究现状[J].辽宁中医药大学学报,2008,10(9):46.
       
       [8]匡莹，鱼红闪.淫羊藿苷糖苷酶产生菌的筛选及其酶反应条件[J].大连轻工业学院学报，2006，25(2)：89.
       
       [9]王侃，鱼红闪，金凤燮，等.芦丁-α-鼠李糖苷酶分离提纯及其酶性质[J].大连轻工业学院学报，2004，23(1)：30.
       
       [10]毛羽，鱼红闪，金凤燮，等.黄芪皂苷糖苷酶产生菌的筛选及其酶反应条件[J].大连轻工业学院学报，2005，24(1)：19.
       
       [11]金冬史，崔允植，鱼红闪，等. 酶法制备人参皂苷Rh2的研究[J].大连轻工业学院学报, 2001, 20(2): 99.
       
       [12]王永宏，苏建，王建芳，等.栀子中京尼平苷的微生物转化研究[J].时珍国医国药, 2007, 18(12): 3003.
       
       [13]吴秀丽，张怡轩，赵文倩，等.真菌EST-I及EST-II对人参皂苷Rg1定向转化为人参皂苷F1的研究[J].沈阳药科大学学报, 2008, 25(1): 73.
       
       [14]刘欣，崔昱，杨凌，等.蜗牛酶中一种人参皂苷Rb1水解酶的分离纯化[J].生物工程学报, 2005,21(6):929.
       
       [15]JIANG Bin-hui, ZHAO Yu-qing, HAN Yin, et al. Enzymatic transformation of notoginsenoside Fe by β-Glucanase[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,2006,15(1):6.
       
       [16]冯冰，马百平，康利平，等.新月弯孢霉对重楼皂苷的生物转化[J].中草药, 2005,36(7):978.
       
       [17]王延亮，张庆林. epothilone类构效关系及生物合成、转化的研究进展[J].国外医学·药学分册, 2007, 34(1): 31.
       
       [18]薛慧玲，徐萌萌，阳泰，等.黄芩微生物发酵产物的分离提取[J].天然产物分离, 2005, 3(5): 5.
       
       [19]许平平，谭银春，鱼红闪，等.酶转化法提高黄芪甲苷的得率[J].大连工业大学学报，2009，28(1):20.
       
       [20]冯冰,马百平.天然产物的生物转化研究进展[J].中草药，2005,36(6):941.
       
       [21]何晨,金钊,冯志华，等.芽孢杆菌发酵炮制中药红花增强溶血栓药效研究[J].中国中药杂志, 2005,30(5): 340.
       
       [22]吴少杰，杨志娟，朱丽华，等.甘草皂苷生物转化的研究[J].中草药, 2003,34(6):516.
       
       [23]李晖，卢定强，刘伟民，等.反相高效液相色谱法测定生物转化体系中的甘草酸[J].色谱,2004,22(3):258.
       
       [24]全波，马百平，冯冰，等.米曲霉(Aspergillus oryzae)对原薯蓣皂苷的生物转化[J].中国天然药物，2006，4(5)：377.
       
       [25]郭永超，林哲绚，罗文鸿，等.短刺小克银汉霉菌对马兜铃酸A的代谢转化[J].药物生物技术, 2006, 13(6): 451.
       
       [26]Braulio M Fraga，Laura Alvare，Sergio Suarez.Biotransformation of the diterpenes eand ieandiol and candicandiol by Mucor Plumbeus[J].J Nat Prod，2003，66:327.
       
       [27]Andres Garcia-Granados，Antonia Fernandez，Maria C Gutierrez，et al.Biotransformation of ent-13-ePimanoyl，oxides difunetionalizedat C-3 and C-12 by filamentous fungi[J].Phytoehemistry，2004，65:107.
       
       [28]Bhushan B, Trott S, Spain JC, et al. Biotransformation of hexahydro-1, 3, 5-trinitro-1, 3, 5-triazine (RDX) by a rabbit liver cyto-chrome P450: insight into themechanism of RDX biodegradation byrhodococcus sp. Strain DN22 [J].ApplEnvironMicrobio,l 2003, 69(3): 1 347.
       
       [29]Ning LL,Zhan JX,Qu GQ，et al. Biotransformation of triptolide by Cunninghamella blakesleana[J].Tetrahedron,2003,59:4209.
       
       [30]张卉,邱峰,曲戈霞，等.微紫青霉对莪术醇的定向转化[J].中国药物化学杂志, 2005, 15(5): 305.
       
       [31]张利平,程克棣,朱平，等.紫杉烷类化合物的生物转化[J].药学学报，2004,39(2):153.
       
       [32]Ro DK, Paradise EM, Ouellet M,et al. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast[J].Nature, 2006, 440(7086): 940.
       
       [33]Giri A, Dhingra V, Giri CC,et al.Biotransformations using plant cells, organ cultures and enzyme systems: current trends and future prospects [J]. BiotechnolAdv, 2001,19(3): 175.
       
       [34]Urlacher V, Schmid RD.Biotransformations using prokaryotic P450 onooxygenases[J].Curr Opin Biotechnol,2002,13(6): 557.
       
       [35]Cirino PC, Arnold FH. Protein engineering of oxygenases forbiocatalysis[J].Curr Opin Chem Biol, 2002,6(2): 130.