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       【摘要】 
       目的建立以RP-HPLC法测定资木瓜中齐墩果酸和熊果酸含量的方法。方法色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.2%磷酸水溶液(90∶10)，流速0.57 ml·min-1，检测波长210 nm。结果齐墩果酸和熊果酸进样浓度分别在6.4～256.0 μg·ml-1和6.32～252.8 μg·ml-1范围内具有良好的线型关系，r分别为0.999 6和0.999 9，平均加样回收率分别为97.4%和96.7%，RSD分别为2.6%和2.2%(n=6)。结论该方法简便、准确、重现性好，可用于控制资木瓜的质量。
       【关键词】  高效液相色谱法;资木瓜;齐墩果酸;熊果酸
       木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa (Sweet)Nakai的干燥近成熟果实，中医认为具有平肝舒筋，和胃化湿等功效，用于湿痹拘挛，腰膝关节酸重疼痛，吐泻转筋，脚气水肿[1]。资木瓜因主产于湖北长阳资丘而得名，与浙江淳木瓜、安徽宣城木瓜齐名，同为皱皮木瓜三大道地药材，是鄂西南特有的一种道地中药材，主要分布在恩施土家族苗族自治州以及宜昌市的长阳、五峰县一带。木瓜中含有的齐墩果酸和熊果酸具有抗癌、提高免疫力、降血脂和降血糖等功效[2]。本文建立了RP-HPLC法测定资木瓜药材中齐墩果酸和熊果酸含量的方法，为资木瓜的质量控制提供依据。
       1仪器与材料
       1.1 仪器Agilent1100高效液相色谱仪(美国安捷伦)，含在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器、化学工作站;CPA124S型电子天平(德国赛多利斯);CQ-80型超声波清洗机。
       1.2 试药齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110709-200505);熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110742-200516);甲醇为色谱纯，注射用水(四川科伦药业股份有限公司，批号：H090519)，其余试剂均为分析纯;资木瓜分别采自湖北省宣恩县长潭河侗族乡易家坪村和湖北省长阳县资丘镇水帘村。
       2方法与结果
       2.1 色谱条件与系统适应性试验色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液(90∶10);柱温27℃;检测波长210 nm;流速0.57 ml·min-1;进样量10 μl。在此色谱条件下，齐墩果酸、熊果酸和前后色谱峰可达到基线分离，齐墩果酸和熊果酸的分离度大于1.5。见图1。
       2.2 对照品贮备液的制备分别精密称取齐墩果酸对照品16.0 mg和熊果酸对照品15.8 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液(其浓度分别为640.0μg·ml-1和632.0 μg·ml-1)。
       2.3 供试品溶液的制备取资木瓜粉末(过120目筛)约1.0 g，精密称定，置50 ml量瓶中，再加入甲醇40 ml超声提取90 min，放冷，再加入甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
       2.4 线性关系考察精密吸取对照品贮备液0.10，0.20，0.50，1.00，2.00和4.00 ml，分别置于10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得到不同浓度的对照品溶液。精密吸取上述6种溶液各10 μl，按上述色谱条件，分别进样，测定。以对照品浓度X(μg·ml-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，得回归方程。齐墩果酸：Y=37.52X-19.75(r=0.999 6)，线性范围6.4～256.0 μg·ml-1;熊果酸：Y=12.56X-25.02(r=0.999 9)，线性范围6.32～252.8 μg·ml-1。结果表明，齐墩果酸和熊果酸分别在相应进样量范围内具有良好的线性关系。a-对照品b-供试品1.齐墩果酸2.熊果酸图1 高效液相色谱图
       2.5 重复性实验取同一批样品(样品4)6份，按“2.3”项下制备并进样测定。结果表明，齐墩果酸和熊果酸含量的RSD分别为1.74%和1.26%，表明本方法重复性好。
       2.6 稳定性实验取“2.5”项下同批样品在4，8，12 h分别进样测定，结果，12 h内齐墩果酸和熊果酸色谱峰面积无明显变化，RSD分别为0.66%和0.54%，表明被测样品在12 h内稳定性良好。
       2.7 精密度实验精密吸取对照品溶液(齐墩果酸和熊果酸浓度分别为64.0和63.2 μg·ml-1)，在上述色谱条件下连续进样6次。结果，齐墩果酸和熊果酸色谱峰面积的RSD分别为0.32%和0.47%，表明本方法精密度良好。
       2.8 加样回收率实验取已知含量的样品(样品4，齐墩果酸和熊果酸含量分别为：5.21 mg·g-1和3.16 mg·g-1)适量，约0.5 g，共6份，精密称定，分别精密加入对照品贮备液1.0，2.0和4.0 ml，按上述方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果表1。
       2.9 样品含量测定分别取不同批次资木瓜样品按供试品溶液制备法制备并进行进样、测定。结果见表2。表1加样回收率实验结果
       3讨论
       熊果酸和齐墩果酸为同分异构的五环三萜酸，由于结构相似导致其性质极为相近，在进行液相分离时其保留时间十分接近而很难分离。考虑到流动相比例、柱温及流动相流速对二者分离影响较大，经多次试验，发现选择甲醇-0.2%磷酸水溶液(90∶10)为流动相，柱温27℃，流速0.57 ml·min-1时齐墩果酸和熊果酸能较好分离，分离度大于1.5。表2样品含量测定结果由表2可知，4批药材中均含有齐墩果酸和熊果酸，但不同产地资木瓜中齐墩果酸和熊果酸的含量差别较大，是否与资木瓜炮制方法或采收时间不一致有关还有待进一步研究。
       【参考文献】
         　[1]国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：41.
       
       [2]Liu J.Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid[J].J Ethnopharmacol，1995，49(2)：57.