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       【摘要】 
       目的对柴芩清肝汤的HPLC指纹图谱进行研究，建立其质量评价体系。方法采用HPLC梯度洗脱技术进行分离。色谱柱为Diamonsil C18(5 μm, 250 mm×4.6 mm)，保护柱为Diamonsil C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，检测波长230 nm，柱温25℃。结果确定了19个共有峰，并对各共有峰进行了初步归属。10批样品指纹图谱的相似度均在0.90以上。结论该方法准确可控，可用于柴芩清肝汤的质量控制。
       【关键词】  柴芩清肝汤;高效液相色谱;指纹图谱
       柴芩清肝汤的原方是由柴胡、黄芩、白芍、甘草等制成的中药制剂，经多年的临床实践证明，其对慢性肝炎等疾病有较好的疗效。该方剂是集中医理论、现代研究和临床经验为一体的良好组合，具有疏肝解郁、消热解毒之功效。由于中药复方成分复杂，仅对某个成分进行定性、定量分析并不能有效控制其质量，中药指纹图谱作为目前公认的中药和天然药物质量控制的有效手段，其研究着眼于对象的宏观特征及内在规律，具有整体性和模糊性等基本特点，符合中药药效模式[1，2]。本实验运用HPLC法对柴芩清肝汤进行研究，确立其色谱条件，建立指纹图谱共有模式，从而从整体上控制柴芩清肝汤的质量。
       1仪器与试药
       Waters600-2487型高效液相色谱仪 Empower色谱工作站(美国.沃特斯公司);AG 135型电子天平(瑞士METTLER-TOLEDO公司);KQ-300VDE型双频数控超声泼清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。柴胡、黄芩等药材均购于哈尔滨市宝丰大药堂，经检验符合《中国药典》规定。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为分析纯。
       2方法与结果
       2.1色谱条件色谱柱为Diamonsil C18(5 μm, 250 mm×4.6 mm)，保护柱为Diamonsil C18;流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，见表1;流速1.0 ml/min; 柱温25℃;检测波长230 nm;进样量10 μl。
       2.2对照品溶液的制备取黄芩苷、芍药苷和甘草苷各5 mg，精密称定，分别置5 ml容量瓶中，加甲醇适量使溶解，定容，即得。
       2.3供试品溶液的制备取柴胡、黄芩、白芍、甘草药材，制成柴芩清肝汤[3]。经冷冻干燥制成冻干粉。同法制备10批冻干粉。精密称取冻干粉0.5 g， 置25 ml容量瓶中，加甲醇20 ml，超声处理30 min，放凉，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。同法制得10批冻干粉的供试品溶液。表1梯度洗脱程序
       2.4参照峰的选择黄芩苷为本方有效成分之一，在HPLC图谱中峰面积较大，出峰时间适中且稳定，故选择黄芩苷为参照峰[4]。
       2.5方法学考察
       2.5.1精密度实验精密吸取同一供试品溶液10 μl，连续进样5次，记录指纹图谱。以13号峰黄芩苷为参照峰，各共有色谱峰保留时间的RSD值均在0.5%以下, 各共有色谱峰相对峰面积间的RSD值均在5.0%以下。表明进样方法和仪器精密度良好。
       2.5.2稳定性实验精密吸取同一供试品溶液10 μl，分别在0，2，4，6，8，12，24 h进样，记录指纹图谱。以13号峰黄芩苷为参照峰，各共有色谱峰保留时间的RSD值均在0.6%以下, 各共有色谱峰相对峰面积间的RSD值均在5.0%以下。表明样品溶液在24 h内稳定。
       2.5.3重复性实验取同一批样品5份，按供试品制备方法进行制备，记录指纹图谱。结果，各共有色谱峰保留时间的RSD值均在0.6%以下, 各共有色谱峰相对峰面积间的RSD值均在5.0%以下。样品处理方法重复性良好。
       2.6指纹图谱的建立将各供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定各样品的HPLC指纹图谱，见图1。经比较分析，确定19个色谱峰为柴芩清肝汤的共有峰，见图2。通过与药材指纹图谱的比较，对各峰进行了归属，其中1~5号峰来自白芍;6,7,10,13~20号峰来自黄芩;9号峰来自甘草。8号峰为白芍，黄芩，甘草共有;11号峰为白芍，甘草共有;12号峰为甘草，黄芩共有。通过与对照品比较，确定5号峰为芍药苷，9号峰为甘草苷，13号峰为黄芩苷。图1柴芩清肝汤10批样品的HPLC指纹图谱
       2.7指纹图谱相似度分析指纹图谱相似度分析的目标在于通过对指纹图谱进行整体上的分析，来达到评价样品质量是否一致的目的[5]。本实验运用了国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A)进行色谱匹配，计算相似度，结果10批样品的相似度分别为：0.927，0.904，0.900，0.903，0.904，0.904，0.942，0.940，0.939 ，0.933，均在0.9以上。图2柴芩清肝汤共有模式HPLC指纹图谱
       3讨论
       实验比较了甲醇-不同浓度磷酸水体系、乙腈-不同浓度磷酸水体系，实验结果表明乙腈-0.1%磷酸水体系较好，基线漂移小，出峰数目多，峰分离情况比较理想。在此基础上，调整乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱的比例关系，最终确定了色谱洗脱条件。分别考察了210，230，254，280 nm波长进行指纹图谱的直观比较，结果230 nm波长检测所得的图谱基线比较稳，分离较好，峰数较多，故选择230 nm为测定波长。相似度评价是指纹图谱研究的一个重要组成部分，所建立的柴芩清肝汤HPLC指纹图谱中，共有19个共有特征(指纹)峰，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积较稳定，所建立的方法有较好的重复性，精密度和稳定性，为柴芩清肝汤的质量控制以及衡量其质量的优化提供了科学依据[6]。
       方中柴胡具有解表和里、疏肝解郁、升举阳气等功效，其中皂苷类成分被认为是其主要的药效成分。但是柴胡皂苷类成分只在紫外末端(203~210 nm)有较弱的吸收[7～9]，因此，在中药复方这个复杂的化学背景下，难以实现对柴胡皂苷类成分的检测，有待于下一步利用蒸发光散射检测法进行分析。
       【参考文献】
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