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       【摘要】 
       目的研究不同莪术提取物对小鼠皮肤癌的药效。方法设计了二甲基苯蒽(DMBA)致小鼠皮肤癌动物模型，从对小鼠体质量增长的影响，抑瘤率，外周血常规检测，脾脏、胸腺指数4个方面进行了药效评价研究。结果莪术提取物对小鼠皮肤癌的药效明显。结论莪术超声提取物研究开发价值较大。
       【关键词】  莪术提取物;超声法;水蒸气蒸馏法;皮肤癌
       莪术作为传统中药具有活血化瘀的功效。现代研究表明，其活性成分莪术醇、莪术酮、牻牛儿酮、β-榄香烯、姜黄素(Ⅰ) 、脱甲氧基姜黄素(Ⅱ) 和双脱甲氧基姜黄素(Ⅲ)等在抗病毒、抗肿瘤方面的确切疗效和作用,为其带来了广阔的发展空间和市场，其不仅能直接抑制、破坏肿瘤细胞和灭活病原体,而且还可以增强机体自身的免疫功能,从而促进机体对肿瘤和病毒的免疫反应[1，2]。现目前工业化生产主要采用水蒸气蒸馏法提取莪术挥发油类成分，其水溶液成分因长时间受热导致药用成分损失破坏。60%超声醇提法在不改变莪术有效成分结构的前提下，不仅可以提得挥发油类成分，还可以提得姜黄素类等醇溶性以及水溶性成分，且提取效率高，省工、省时、节能，使得中药提取既符合传统的中医药理论，又能达到提高有效成分的收率和纯度的目的。针对皮肤癌的适应证，我们设计了小鼠皮肤癌动物模型，从对小鼠体质量增长的影响，抑瘤率，外周血常规检测，脾脏，胸腺指数4个方面进行了药效评价研究，为制剂工艺研究提供了参考[3~6]。
       1仪器与试药
       BP211DAG电子天平(德国Sartorius)，SHZ型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)，KDM型控温电热套，DL-720D型数控超声波仪(昆山市超声仪器公司)，超声提取器(上海必能信)，micromax高速离心机(美国热电)。生理盐水,莪术挥发油,莪术水提药液,莪术醇提液,DMBA (二甲基苯蒽), GST-π多克隆抗体(NCL-GSTpi)购自于Novocastra公司，AP免疫试剂盘均购自Sigma公司，KM小鼠由实验动物中心提供。
       2方法与结果
       2.1小鼠皮肤癌模型试验
       2.1.1小鼠皮肤癌造模20只KM小鼠，在无菌室温下喂养，2~3周龄。动物分为两组： 实验组：在10只实验组小鼠皮肤上，每天1次涂含60%DMBA(二甲基苯蒽)的矿物油，直至10 d;对照组：在10只对照组模型小鼠皮肤上，只涂矿物油,在10 d末处死，经大体检查后切取皮肤[4~12]。
       2.1.2皮肤癌模型的检测 小鼠皮肤标本制备 所有的皮肤标本用10%中性福尔马林固定，石蜡标本制备，组织切片厚为5 μm，进行常规苏木素和伊红染色。GST-π免疫组织化学染色：运用PAP免疫组织化学染色方法,对不同病变标本的石蜡切片进行染色。PAP显色采用AEC试剂盒，核复染用Mayer/s苏木索。GST-π在小鼠正常皮肤中染色呈阴性,在鳞状细胞癌病变皮肤中显色呈阳性(见表1)。本实验结果表明所造模型为皮肤癌动物模型。表1GST-π在小鼠正常皮肤和病变皮肤中的显色情况
       2.2 药效评价实验
       2.2.1供试品溶液的制备 莪术油乳液：1.2 ml莪术油，加60%的乙醇80 ml，再加吐温-80 20 ml，制备成莪术油乳液备用。莪术超声提取乳液：100 g莪术药材，用醇提超声的最佳工艺提取，浓缩，离心除杂30 min(3 000 r/min)，回收乙醇，浓缩至干浸膏，再加60%乙醇稀释至80 ml，再加吐温-80 20 ml，制备成莪术超声提取微乳液备用。莪术水提乳液：100 g莪术药材，水蒸气蒸馏提取挥发油后的水提液，浓缩后，离心除杂30 min(3 000 r/min)，再浓缩至干浸膏，再加60﹪乙醇稀释至80 ml，再加吐温-80 20 ml，制备成莪术水提取微乳液备用。
       2.2.2实验方法
       随机分组：将50只KM小鼠按体质量和性别采用“均衡随机”法分成4组，每组10只，雌雄过半，50只小鼠称重，并标记。第1组为对照组，第2组、第3组以及第4组为治疗组。小鼠皮肤癌模型的建立：模型动物组小鼠皮肤上，每天1次涂含60%DMBA(二甲基苯蒽)的矿物油，直至10 d。给药剂量和给药方式：从第11天开始，对照组小鼠皮肤上，每天1次涂生理盐水。第2组每天1次涂莪术超声提取乳液、第3组每天1次涂莪术油乳液以及第4组每天1次涂莪术水提乳液。每次约0.8g左右。
       2.2.3实验结果对小鼠体质量增长的影响见表2。表2莪术微乳液对细胞癌小鼠体质量的影响各组小鼠体质量均有不同程度的增加，水提组体质量增加最少，油乳组体质量增加量与荷瘤对照组比较差异显著(P<0.01)。超声组和水提组可能因为其所提取的姜黄素等活血化瘀成分，能显著降低胆固醇、脂肪酸等导致体质量变化与荷瘤对照组没有显著性差异，针对适应证，由体质量变化可以看出油乳组有利于皮肤癌的治疗。抑瘤率计算：于给药后第14天，将各组小鼠眼球采血后处死，称质量，依次用碘酊酒精消毒操作部位皮肤，于超净工作台上，以无菌操作完整剥取肿瘤皮肤，剥离干净后于电子天平称瘤体质量并按公式计算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-治疗组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100%。表3莪术微乳液对细胞癌小鼠体质量的影响超声组、油乳组、水提组瘤质量与对照组相比差异均显著。尤其是超声组和油乳组有明显的抑制肿瘤生长作用，抑瘤率分别达32.98%和31.27%，水提组也有一定的抑瘤作用，抑瘤率达12.96%。外周血常规检测 小鼠眼球采血，血细胞自动分析仪检测血常规。表4莪术微乳液对细胞癌小鼠外周血象的影响荷瘤鼠在应用莪术微乳液后WBC、MCV均有所降低，而对RBC、HGB影响不大;超声组与荷瘤对照组相比PLT差异显著(P<0.01)，油乳组与荷瘤对照组相比PLT有显著差异(P<0.05)，表明莪术乳液透皮吸收有显著的抗凝血作用，即有显著的活血化瘀的作用。脾脏、胸腺指数：小鼠处理后，以无菌操作取下脾脏、胸腺，电子天平称质量并计算脏器指数。表5莪术微乳液对细胞癌小鼠免疫器官质量的影响荷瘤鼠在涂莪术样品液后胸腺指数和脾脏指数均下降，超声组与荷瘤对照组相比脾脏指数差异显著(P<0.01)，油乳组与荷瘤对照组相比胸腺指数以及脾脏指数均有显著差异(P<0.05)。水提组与荷瘤对照组相比胸腺指数以及脾脏指数差异不明显。
       3讨论
       药效评价实验表明，针对皮肤癌的适应证莪术提取物有较好的抑瘤效果，且活血化瘀疗效显著，能改善血细胞，提高机体免疫力，故有利于皮肤癌的治疗。就适应症而言，莪术对皮肤癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、直肠癌等等都有一定程度的治疗以及辅助治疗作用，尤其是超声提取物里面含有的活血化淤类以及增强人体免疫活性类成分等在体内可以改善血液流变学参数以及增强在体对病毒性感染的抵抗能力，起到对实体肿瘤以及病毒性感染的辅助治疗作用，故超声提取物研究开发价值较大。
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