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       【摘要】 
       目的优化熟地黄粗多糖提取与初步纯化最佳工艺。方法用正交实验法，以加水量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)作为3因素，以干膏收率(%)和多糖含量(%)为指标，采用单因素实验筛选醇沉浓度和氯化钙脱蛋白最佳浓度。结果各因素对多糖含量和收膏率综合评分并没有显著性影响，醇沉浓度以80%最优，氯化钙脱蛋白最佳浓度(W/V)为7%。结论熟地粗多糖最佳提取工艺为A3B1C3，即加8倍量水，提取2次，每次4 h，醇沉浓度为80%，脱蛋白最优浓度为7%。
       【关键词】  熟地黄粗多糖;提取工艺;醇沉浓度;脱蛋白
       地黄来源于玄参科植物地黄Rehmanniag lutinosa Libosch新鲜或干燥块根，为常用中药。熟地黄是地黄的炮制品，具有益精填髓、滋阴补血的功效，用于肝肾阴虚、目昏耳鸣、腰虚酸软、骨蒸潮热、内热消渴、血虚萎黄、心悸怔忡、月经不调、崩漏下血、眩晕耳鸣、须发早白等症。熟地黄粗多糖是熟地黄抗焦虑的主要活性部位之一[1]。为了获得比较理想的提取效率，我们开展了熟地黄粗多糖提取、初步纯化工艺研究。现报道如下。
       1仪器与材料
       1.1仪器UV-2201可见紫外分光光度计(日本岛津)，RE52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，DZF-6020真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。
       1.2试剂硫酸、苯酚(用前重蒸)、无水氯化钙，均为AR，D-无水葡萄糖(中国药品生物制品检定所，批号：110833-200503);牛血清白蛋白(化工生物工程 (上海有限公司);考马斯亮蓝G250[化工生物工程 (上海有限公司)]。
       1.3药品熟地黄，由河南中医学院李军老师提供，产地河南武陟，基地(酒蒸)，第3批，经本院陈随清教授鉴定为正品。
       2方法与结果
       2.1多糖含量测定[2～4]
       2.1.1标准曲线的绘制精密称取P2O5干燥器干燥至恒重的葡萄糖标准品25.02 mg，加水溶解定容，配制成0.100 08 mg/ml对照溶液备用。精密吸取葡萄糖对照溶液0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 ml置于10 ml的干燥具塞刻度试管中，依次加水使体积均为1.0 ml，另取1.0 ml蒸馏水作空白对照，再分别加入5%苯酚溶液1.0 ml，摇匀，迅速用酸式滴定管滴加浓H2SO4 5.0 ml，充分摇匀，室温放置30 min，在最大吸收波长488 nm处测定吸光度值，数据处理得回归方程：A=0.062 1 C-0.015 1(r=0.997 4 )。葡萄糖浓度在2.859～10.008 μg/ml范围内线性良好。
       2.1.2方法学考察精密度实验：将同一份对照品溶液反复测定6次，RSD=0.49%，表明仪器精密度良好。重复性实验：取同一样品6份，按标准曲线方法平行操作，测得吸光度，RSD=2.69%，n=6，重复性较好。稳定性实验：将样品每隔30 min测定1次，结果在2 h内基本稳定，RSD=2.36%。加样回收率实验：精密吸取样品液6份，均为0.2 ml，分别加入葡萄糖对照液0.1，0.1，0.2，0.2，0.3，0.3 ml，按标准曲线方法测定吸光度，平均回收率102.01%，RSD=3.01%。
       2.1.3样品含量测定将定容好的多糖溶液，按标准曲线下方法操作，测得吸收度，代入回归方程，计算多糖含量。
       2.2干膏收率的测定将定容的多糖溶液，吸取25 ml至已干燥称重的蒸发皿中，真空干燥至恒重。计算收膏率。收膏率(%)=(称得干膏重量×稀释倍数/药材重量 )×100%。
       2.3蛋白质含量测定[5]
       2.3.1标准曲线的绘制精密称取牛血清白蛋白10.68 mg，加超纯水定容至500 ml。精密称取考马斯亮蓝 G 250 10.52 mg ，溶于 5 ml 90 %(V/V)的乙醇(蓝色)中 ，再加入85 %(M/V)的磷酸(血红色)10ml ，最后用超纯水定容至100 ml(褐色)，备用。精密吸取对照品溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml置干燥具塞试管中依次加水至1 ml，加入考马斯亮蓝G250试剂5 ml，摇匀，在最大吸收波长594 nm处测定吸收度，以吸收度对浓度绘制标准曲线，得A=0.033 1C+0.006 6，r2=0.999 3，蛋白质标准品在0.712～3.56 μg/ml范围内线性良好。
       2.3.2方法学考察
       精密度实验：将同一份经显色的对照品溶液测定5次，RSD=2.98%。重复性实验：吸取同一样品液5份，按标准曲线方法平行操作，测定吸收度，RSD=3.05%。稳定性实验：将同一份样品，每隔30 min测定1次吸收度，3 h内基本稳定，RSD=3.81%。加样回收率实验：精密吸取样品液6份，均为0.2 ml，分别加入蛋白质对照液0.1，0.1，0.2，0.2，0.3，0.3 ml，按标准曲线方法测定吸光度，平均回收率98.61%，RSD=2.27%。
       2.3.3样品含量测定将脱过蛋白溶液稀释至适当倍数，在594 nm处测定吸收度，计算含量。
       2.4正交实验优选熟地黄多糖水提工艺
       2.4.1提取方法称取熟地黄干燥品适量，分别加水，于98～100℃依次浸提，溶液滤过，合并滤液，减压浓缩至相当于生药0.5 g/ml。加95%乙醇使醇沉浓度达到80%，静置24 h。抽滤，得粗多糖，再加95%乙醇反复洗涤，脱脂和除去部分单糖。将沉淀挥至无醇味，加水溶解，过滤，定容。以加水量、提取时间、提取次数为考察因素，每因素设3个水平，以干膏收率(%)，多糖含量(以葡萄糖计)为指标，综合评分Y=0.4a+0.6b(a为干膏收率，b为多糖含量)。因素水平表见表1。表1熟地多糖提取工艺正交因素和水平
       2.4.2多糖含量和干膏收率测定将正交9份溶液稀释合适倍数，测定方法按“2.1”项和“2.2”项操作。
       2.5单因素实验优选醇沉浓度
       2.5.1方法称取熟地药材适量，加10倍量水，于98~100℃提取浸提2次，每次4 h，合并滤液，减压浓缩至相当于生药0.5 g/ml。分别吸取5份10 ml药液，加95%乙醇使醇沉浓度分别达到30%，50%，70%，80%，90%，静置24 h，抽滤，得粗多糖，用95%乙醇反复洗涤沉淀，挥至无醇味，定容。
       2.5.2多糖含量和干膏收率测定 将以上5份溶液稀释相同倍数，测定方法同“2.1”项和“2.2”项。
       2.6单因素实验优选脱蛋白工艺
       2.6.1方法[6]称取熟地黄饮片50.0 g，按优选的水提醇沉工艺，药液定容至相当于原药材0.5 g/ml。分别吸取4份，均为10 ml，至已经干燥的小烧杯中，加1 mol/L的NaOH调pH至8～9。水浴加热至85℃，加入无水氯化钙使浓度(W/V)分别达到3%，5%，7%，10%。搅拌溶解，取出，放至室温，离心15 min，3 000 r·min-1，弃沉淀，定容。
       2.6.2多糖保存率和蛋白脱除率测定用“2.1”项方法测得多糖含量，计算多糖保存率。按“2.3”项测定蛋白含量，计算多糖保存率和蛋白脱除率。计算公式如下。多糖保存率(%)= 脱蛋白前多糖含量-脱蛋白后多糖含量脱蛋白前多糖含量×100%　　蛋白脱除率(%)= 脱蛋白前含量-脱蛋白后含量脱蛋白前含量×100%
       2.7熟地黄粗多糖提取、纯化工艺验证性实验取3批熟地黄药材，按以上优选的工艺进行提取、纯化，药液干燥至恒重，测定收膏率和多糖含量。
       2.8实验结果
       2.8.1熟地黄多糖水提工艺结果结果见表2～3。表2水提工艺实验结果表3熟地多糖提取工艺综合评分方差分析结果由直观分析可知，影响水提因素顺序为：C>A>B，即提取次数>加水量>提取时间。但各因素并没有显著性差异，考虑多糖一般提取时间较长，根据正交结果表2，B选择B1，C、A根据生产实际考虑，可选择C3A3，综合选择最优方案为 A3B1C3。即加8倍量水，提取2次，每次4 h。
       2.8.2醇沉浓度优选结果结果见表4。从结果可以看出熟地多糖最佳醇沉浓度为80%。
       2.8.3脱蛋白工艺优选结果结果见表5。表4不同醇沉浓度对干膏收率和多糖吸收度的影响表5不同氯化钙浓度对多糖保存率和蛋白脱除率的影响
       2.8.4熟地黄粗多糖提取、纯化工艺验证试验结果收膏率和干膏中多糖含量见表6。表6工艺验证性试验结果
       3讨论
       实验中，将一定浓度葡萄糖对照品溶液加苯酚、硫酸显色，用紫外可见分光光度计在400～550 nm范围内进行波长扫描，结果在488 nm处有最大吸收。将蛋白对照品溶液加显色剂后进行全波长扫描，在494 nm处有最大吸收。
       本实验首次采用无水氯化钙对熟地黄粗多糖进行脱蛋白，操作简便，经济无毒，适用于工业化生产。无水氯化钙脱蛋白是利用盐析的原理[7]，蛋白质在高浓度的盐溶液中，随着盐浓度的逐步增加，蛋白质水化膜破坏，溶解度下降而从溶液中沉淀出来。最佳脱蛋白效果仅有50.54%，可能大量的蛋白与多糖结合，这些结合蛋白较难脱除。寻找高效、安全、适合工业生产的脱蛋白方法，仍需进一步探索、研究。
       本实验选用苯酚-硫酸法测定地黄多糖含量，计算出含量较高，这可能因为粗多糖中含有较多单糖、低聚糖，参与显色，以至吸光度增大。为此进一步研究，按本文中方法进行提取、初步纯化，3批药材熟地黄粗多糖平均得率为35.48%。进一步进行透析(透析袋分子量8 000～12 000)，得率仅有5%左右，这也印证了以上观点。不过本实验仅以含量为指标筛选工艺，误差同等，筛选出来的结果还是科学可行的。
       【参考文献】
         　[1]崔瑛，冯静，王辉，等.熟地黄干预小鼠焦虑行为实验[J].中国临床康复，2006，10(43)：61.
       
       [2]纪耀华，孙莹，高松红，等.地黄炮制前后总多糖含量的比较[J].中医药信息，1999，16(5):16.
       
       [3]陈韩英，李炳奇，刘红，等.熟地多糖的微波提取和含量测定[J].时珍国医国药，2004，15(8):488.
       
       [4]李红霞，许闵，孟江，等.怀地黄多糖含量测定[J].河南科学，2002，20(2):144.
       
       [5]赵英永，戴云，崔秀明，等.考马斯亮蓝G-250染色法测定草乌中可溶性蛋白质含量[J].云南民族大学学报，2006，15(13):236.
       
       [6]黄纯，马驰，宋慧智，等.亮菌多糖提取中脱蛋白和脱色方法比较[J].药学与临床研究，2007，15(1):46.
       
       [7]郝少莉，仇农学.沉淀分析技术在蛋白质处理方面的应用[J].粮食与食品工业，2007，14(1):20.