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       【摘要】 
       目的研究六月青石油醚萃取物(petroleum ether extract of LYQ，LYQPE)对人胃腺癌SGC-7901细胞凋亡的影响及其部分作用机制。方法用不同浓度的LYQPE作用于SGC-7901，作用48 h后，流式细胞术检测对细胞凋亡及其凋亡相关蛋白p53影响;RT-PCR检测凋亡相关基因p53 mRNA和黏附基因CD44 mRNA的变化;电镜观察超微结构变化。结果LYQPE体外作用于SGC-7901，在40~320 μg/ml时呈不同程度的促进凋亡;呈剂量依赖性的抑制p53蛋白、mRNA水平和CD44 mRNA水平的表达;在160μg/ml时，电镜观察可见典型的凋亡形态学改变。结论LYQPE对SGC-7901有明显促凋亡作用;LYQPE抑制SGC-7901 p53蛋白、mRNA水平和CD44 mRNA水平的表达有可能是促进SGC-7901凋亡的作用机制。
       【关键词】  六月青石油醚萃取物;SGC-7901;流式细胞术;细胞凋亡;RT-PCR;电镜
       胃癌是我国最常见的肿瘤之一，其死亡人数在我国居恶性肿瘤的首位[1]。手术对早期胃癌有较好的疗效，但对中晚期的胃癌疗效欠佳。因此寻找疗效好、副作用小的治疗方法仍是目前肿瘤研究的焦点之一。六月青系爵床科植物肖鸡笼的干燥地上部分，是一种广西民间草药。《本草拾遗》记载，其能活血、凉血、舒肝泻湿、消肿止痛，主要用于急慢性肝炎、黄疸等[2]。中医学理论中肝克脾，胃为脾之腑，胃与脾相表里，说明肝与胃是有中医理论功能联系的。前期实验对六月青各化学部位进行了初步筛选，结果表明六月青石油醚部位体外对胃腺癌细胞系SGC-7901和MKN-45有明显的抑制作用。关于六月青的研究资料报道中，石油醚部位能显著增加小鼠胸腺重量和小鼠血清溶菌酶的含量[3]，表明六月青石油醚萃取物有一定的增强免疫作用。本实验室用醇提石油醚萃取的方法得LYQPE，经初步的实验，有较好的抗瘤效果，且未发现明显的毒副作用。本实验旨在研究六月青石油醚萃取物对人胃腺癌SGC-7901细胞凋亡的影响及其部分作用机制。
       1材料与仪器
       1.1细胞SGC-7901胃癌细胞株由第四军医大学试验动物中心提供，由本实验室自行传代培养。细胞常规培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃ 5% CO2及饱和湿度下培养，隔天换液，待细胞生长80%～90%密度时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代。
       1.2药物六月青，采于广西灵山县，经广西中医药研究所鉴定，其地上部分粗粉用85%乙醇回流提取，过滤得滤液经旋转蒸发回收乙醇，浓缩液用溶剂石油醚萃取，萃取液经旋转蒸发回收石油醚后收集，恒温箱烘干得LYQPE备用;5-FU，上海旭东海普药厂，批号：061006; LYQPE用含10%DMSO的RPMI-1640溶液配制成浓度分别为6.4，3.2，1.6，0.8 mg/ml的溶液各5 ml，备用。5-FU作为阳性药用含10% DMSO的RPMI-1640溶液配制成2 mg/ml的溶液5 ml，备用。
       1.3试剂Annex V凋亡试剂盒，Biovision公司;p53检测试剂盒，BD Bioscience公司;RPMI-1640培养液，购自美国Gibco公司; PBS，美国Gibco公司;胰蛋白酶，美国Amersco公司;Trizol，美国Invitrigen公司;First strand cDNA synthesis kit，美国MBI;DEPC美国Sigma公司;2×PCR TaqMix，Takara公司;PCR扩增引物，北京三博远志公司;戊二醛，美国Sigma公司。
       1.4仪器PTC 200多通道PCR扩增仪，美国MJ公司生产;Epics XL流式细胞仪，美国Beckmon - Coulter公司生产。
       2方法
       2.1细胞凋亡的流式细胞术检测取对数生长期SGC-7901 1×105培养于50 ml培养瓶中24 h，LYQPE 设终浓度分别为40，80，160，320 μg/ml，5-FU 100 μg/ml和空白对照组。共同培养48h，0.25%胰酶消化，PBS冲洗2次，用100 μl 含钙离子buffer重悬，加5 μl Annex V-FITC染料染色20～30 min，加5 μl PI燃料染色5 min，加入适量含钙离子buffer调整细胞浓度到1×105个/ml左右，上流式细胞仪检测。激发波长为488 nm，发射波长530 nm。
       2.2流式细胞仪检测p53蛋白取对数生长期SGC-7901细胞1×105培养于50 ml培养瓶中24 h，LYQPE 设终浓度分别为40，80，160，320 μg/ml，5-FU 100 μg/ml和空白对照组。共同培养48 h，0.25%胰酶消化，PBS冲洗2次，加入1%多聚甲醛100μl固定15 min，3 ml PBS洗1次，加入0.1% saponin 100 μl破膜5~10 min，分成两管，分别加入10 μl IgG-FITC和p53-FITC，染色15 min，3 ml PBS洗1次，加入0.5～1.0ml PBS上机检测。激发波长为488 nm，发射波长530 nm。
       2.3p53和CD44RT-PCR检测取对数生长期SGC-7901细胞1×105培养于50 ml培养瓶中24 h，LYQPE 设终浓度分别为40，80，160，320 μg/ml，5-FU 100 μg/ml和空白对照组。共同培养48 h，细胞总RNA的提取参照Trizol试剂盒说明书进行。逆转录反应后，加入下列引物进行PCR扩增：p53(117 bp)上游5"-TTTGGGTCTTTGAACCCTTG-3"，下游5"-CCACAACAAAACACCAGTGC-3";CD44(134 bp)上游5"-CCAGCTAAGGACATTTCC CA-3"，下游5"-ACTAGTACACCCCAACCCCC-3";同时以GAPDH (452 bp)上游5"-ACCACAG TCCATGCCATCACT-3"，下游5"-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3"作为反应内参照.扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶图像分析仪检测p53和CD44与GAPDH扩增片段灰度的比值。
       2.4超微结构的电镜观察取对数生长期SGC-7901细胞1×105培养于50 ml培养瓶中24 h，LYQPE 设终浓度为160 μg/ml和空白对照组。共同培养48 h，0.25%胰酶消化，离心，2%戊二醛固定，送电镜室制备标本，照相。
       2.5统计学处理采用SPSS13.0统计软件，量的数据均以±s表示，比较采用t检验，率的比较采用卡方检验。
       3结果
       3.1LYQPE对SGC-7901细胞凋亡的影响与对照组相比，40~320 μg/ml LYQPE不同程度的促进SGC-7901凋亡，但有一个明显的规律是随着LYQPE计量的增加，正常细胞的比例逐渐下降，在80 μg/ml LYQPE以促进SGC-7901凋亡为主(28.2%)，在320 μg/ml LYQPE以促进SGC-7901坏死为主(24.6%)。结果见表1。表1LYQPE作用48h，流式细胞术检测SGC-7901坏死、　　正常和凋亡细胞比例变化
       3.2LYQPE对SGC-7901 p53的影响
       3.2.1p53蛋白表达的流式细胞术检测与空白对照组(55.4%)相比，40~320 μg/ml LYQPE呈剂量依赖性地抑制SGC-7901的p53蛋白表达，随着剂量增加，p53蛋白阳性表达细胞分别为：23.40%**，17.70%**，12.80%**和8.81%**(**P<0.01)。结果见图1。图1LYQPE作用48 h对SGC-7901 p53蛋白表达的影响
       3.2.2p53 mRNA表达的RT-PCR检测p53与GAPDH mRNA的比值( ±s, n=3)，与空白对照组(0.767±0.028)相比，40~320 μg/ml LYQPE呈剂量依赖性地抑制SGC-7901的p53 mRNA表达，随着剂量增加，p53 mRNA相对表达量分别为： 0.657±0.022、0.645±0.016**、0.571±0.026**和0.555 0.021**(**P<0.01)，结果见图2。
       3.3CD44 mRNA表达的RT-PCR检测CD44与GAPDH mRNA的比值(±s, n=3)，与空白对照组(0.417±0.029)相比，40~320 μg/ml LYQPE呈剂量依赖性地抑制SGC-7901的CD44 mRNA表达，随着剂量增加，CD44 mRNA相对表达量分别为：0.430±0.019，0.342±0.019*，0.253±0.018**和0.152±0.022**(**P<0.01)。结果见图3。
       3.4SGC-7901超微结构变化的电镜观察A1、A2和A3为正常SGC-7901细胞，可见细胞膜、核膜完整，胞核大，核质均匀，核仁明显，细胞微绒毛，即指状突起，胞浆核糖体丰富。A4、A5和A6为LYQPE作用后的SGC-7901，可见胞质内大量空泡，胞核变形，核碎裂，胞核消失，全胞深染，细胞器消失。结果见图4。M：marker;P：5-FU 100 μg/ml;C：空白对照组;L、I、H和VH：依次为LYQPE 40，80，160和320 μg/ml图2LYQPE作用48h，RT-PCR检测SGC-7901p53的mRNA表达量的变化M：marker;P：5-FU 100μg/ml;C：空白对照组;L、I、H和VH：依次为LYQPE 40、80、160和320 μg/ml图3LYQPE作用48 h，RT-PCR检测SGC-7901 CD44的mRNA表达量的变化A1~A3：为正常SGC-7-901细胞，A4~A6：为ZYQPE作用后SGC-7-901细胞图4LYQPE作用48 h，透射电镜观察，SGC-7-901超微结构变化
       4讨论
       胃癌的发病率高并且难治，目前以手术、放疗和化疗为主要治疗手段。研究证实胃癌患者在接受放化疗手术后，如能给予药物辅助治疗将对改善患者生活质量和提高生存率具有重要意义[4]。
       从中药中寻找抗肿瘤有效成分具有广阔的前景，已经引起国内外许多学者的关注。六月青在广西分布广泛，一些初步的试验证实其有一定的抗肿瘤活性，本实验室前期动物试验结果表明LYQPE能抑制S180荷瘤小鼠移植性肿瘤，本研究中所选胃癌细胞，SGC-7901是常用于研究的中分化胃癌细胞株。细胞凋亡(apoptosis)或称程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，即有核细胞在一定条件下启动自身的内部机制使得内源性DNA内切酶激活而引起的细胞死亡过程，即受基因、信使调控的单个细胞自杀过程[5]。凋亡早期形态学改变为：① 细胞皱缩胞浆凝缩，细胞器互相靠近。② 核的致密化是凋亡细胞最重要的形态特点，此时见到核染色质浓聚、固缩，沿着核膜排列，形成不同的形状(如新月状或环状)聚集在核膜周边，然后染色质逐步分裂成碎片。③ 细胞器浓缩，细胞膜下陷，包裹核碎片和细胞器，形成凋亡小体[6]。随肿瘤分子生物学研究的深入，人们已发现愈来愈多的化疗药物可引起肿瘤细胞凋亡[7,8]，诱导凋亡将是筛选抗肿瘤药物的重要研究方向，也是评价药物疗效的可靠指标。磷脂酰丝氨酸外翻分析法(Annexin V-PI)[9]将Annexin V与PI匹配使用，可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。本实验利用磷脂酰丝氨酸外翻分析法所得结果显示，LYQPE能明显促进SGC-7901凋亡，在大剂量主要是导致SGC-7901直接坏死。
       p53基因是影响凋亡过程[10]的重要分子事件，正常存在于细胞内的p53 基因为野生型, 诱导细胞凋亡与其DNA结合功能及基因调控功能有关，对肿瘤细胞增殖起抑制作用[11]。野生型p53在细胞生长过程中，以一种“分子警察”(molecular police) 的身份监控细胞内DNA 状态，p53基因产物参与G1-S和G2-M检查点而对细胞周期调控，如果细胞DNA受损，p53表达增加可诱发细胞周期停止，以利DNA修复，而一旦修复失败，p53蛋白可持续增高，野生型p53 蛋白产物可作为凋亡的强诱导物诱导受损细胞和瘤细胞的凋亡而抑制肿瘤的发生和生长。p53缺乏时，Bcl-2蛋白增高，Bax蛋白表达降低，可使细胞凋亡明显受抑，导致突变细胞扩展。而当p53基因发生突变时，突变型p53能与野生型p53亚单位结合形成寡聚体干扰其功能，可致细胞过度增殖，失去其正常的抑癌功能，细胞凋亡受抑。Hiao等[12]用免疫组化CM-1单抗发现60%的胃癌中有p53基因的表达异常。因此，可通过诱导野生型p53表达或抑制突变型p53表达来促进肿瘤细胞凋亡[13]。SGC-7901为p53突变型胃癌细胞株[14]，本实验结果显示，LYQPE能够在蛋白和mRNA水平抑制突变型p53的表达，从而体细胞进入正常的凋亡途径。
       CD44是一种分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，属于表面黏附因子， CD44的高水平表达与肿瘤的转移和浸润密切相关已被大多数研究所证实[15～18]。CD44基因的外显子按剪接方式的不同分为标准(CD44s)及变异型(CD44v)，而变异型按外显子拼接类型不同又分为许多亚型，其拼接变异体主要表达在上皮源型细胞和肿瘤组织中[19]。变异型CD44作为一种透明质酸的受体，分子的NH2末端功能区能链接细胞外间质受基底膜的透明质酸盐调节细胞的运动和形态，同时“锚”定在宿主细胞外间质及基底膜上，CD44v6阳性细胞更易与毛细血管后小静脉中的高柱状内皮细胞结合，使肿瘤细胞更易进入淋巴系统和循环系统，同时透明质酸降解产物还能启动血管的发生，为侵袭转移奠定基础CD44v6分子在人类胃癌组织中的阳性表达率为64%~77%，其阳性表达与胃癌的进展程度有关[20]。孙喜文等[21]发现，胃癌原发灶CD44v6阳性表达率为62%。周世庆等[22]发现，人胃癌细胞株SGC-7901细胞中CD44v6阳性表达率为69.4%，与国内外报道基本一致。本试验结果显示，LYQPE能够降低SGC-7901的CD44 mRNA水平的表达使其蛋白表达减少，从而使细胞脱壁、漂浮、停止生长，进而导致其凋亡，死亡。
       细胞凋亡时超微结构呈现典型改变，如胞质的固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，这些特征为透射电子显微镜下判定细胞凋亡提供了最直观、最可靠的依据。我们的电镜结果从细胞超微结构水平验证了LYQPE对SGC-7901的抑制作用和促凋亡作用。
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