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       【摘要】 
       目的通过观察化痰通络法联合尿激酶溶栓对急性脑梗塞大鼠不同脑区炎性因子的影响，探讨其对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法SD大鼠136只，随机分为5组，即正常组、假手术组、模型组、尿激酶组、化痰通络法联合尿激酶组，采用自身栓子法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型，分别给予中药灌胃及尿激酶溶栓，Elisa法检测化痰通络法联合尿激酶溶栓对急性脑梗塞后6 h，72 h，7 d,14 d脑组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素细胞-1β(1L-1β)、细胞黏附因子-1(ICAM-1)等炎性因子蛋白表达的影响。结果化痰通络法联合尿激酶溶栓能明显抑制TNF-α、1L-1β、ICAM-1蛋白的表达。结论中药联合溶栓可减少溶栓后缺血再灌注损伤，其机制可能与抑制相关炎性因子表达有关。
       【关键词】  化痰通络法;溶栓;炎性因子;ELISA法;缺血再灌注
       溶栓治疗可以迅速恢复缺血脑组织血流，有效挽救缺血半暗带的功能。但同时带来的再灌注损伤可对病情及预后产生直接影响。再灌注损伤会引起一系列炎症反应，其中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素细胞-1β(1L-1β)、细胞粘附因子-1(ICAM-1)等炎性因子扮演重要角色。本研究采用化痰通络法联合尿激酶干预方式来探讨中药联合溶栓对缺血再灌注损伤，特别是对炎性因子等的影响，为扩大溶栓治疗的临床应用提供科学依据。
       1材料与仪器
       1.1动物选用250～300 g健康SD大鼠136只，8月龄，雌雄各半，清洁级，由军事医学科学院实验动物中心提供[许可证号SCXK-(军)2002-001]。大鼠饲养环境的室温为20～22℃，相对湿度为50%左右。
       1.2试剂大鼠TNF-α ELISA检测试剂盒、大鼠1L-1β ELISA检测试剂盒、大鼠ICAM-1 ELISA检测试剂盒均购自美国ADL公司。
       1.3仪器酶标仪(Mode1550型)采用美国BIO-RAD公司生产;紫外分光光度计(UV-240型)采用日本岛津;高速冷冻离心机(T-124型)采用意大利 Kontron Centrikon。
       2方法
       2.1分组与给药方法随机将大鼠分为5组，即正常组、假手术组、模型组、尿激酶组、化痰通络法联合尿激酶组(以下称中药组)。除正常组外，其余4组又分为6，72 h，7，14 d 4个时间点，每组每个时间点8只大鼠。中药组给予化痰通络法中药(天麻、胆南星、半夏、丹参、川芎、地龙、酒军)煎剂灌胃并结合小剂量尿激酶溶栓治疗;尿激酶组给予蒸馏水代替中药灌胃并结合小剂量尿激酶溶栓治疗。尿激酶采用大鼠尾静脉加速滴注NS 30 m1+UK2.7万U/kg(相当于70 kg人剂量的30万U)，1次/d，共用3 d。
       2.2大鼠大脑中动脉栓塞模型制备首先进行栓子制备，随后参照张新江[1]、刘瑜等[2]法建立大鼠大脑中动脉栓塞模型。模型组、尿激酶组和中药组大鼠均造模。假手术组手术方法同模型制作，只在注射时以生理盐水0.3 ml代替栓子溶液。正常组未进行手术及造模。
       2.3模型制备成功标准除正常组外其余各组均于术后2 h观察动物行为障碍的程度并进行评分，评分标准参考Bederson等[3]的方法。模型成功标准为出现确切的神经功能缺损症状。
       2.4实验指标的检测方法 各组分别相应时间点经相应处理后断头取脑置于冰盘上，剥离缺血侧脑皮层、海马脑组织制成1%的脑组织匀浆，采用免疫组织化学法(Elisa法)检测大鼠脑组织TNF-α、IL-1β及ICAM-1的蛋白表达。
       2.5统计学处理数据以±s表示，采用SPSS11.5医学统计学软件处理，对实验数据进行单因素方差分析。
       3结果
       3.1各组大鼠不同脑区TNF-α蛋白表达含量比较结果见表1。表1各组大鼠不同脑区TNF-α蛋白表达含量比较
       3.2各组大鼠不同脑区IL-1β蛋白表达含量比较结果见表2。
       3.3各组大鼠不同脑区ICAM-1蛋白表达含量比较结果见表3。
       4讨论
       溶栓后缺血再灌注损伤是溶栓治疗后常见并发症之一，也是影响溶栓疗效的重要原因。研究显示，炎症反应在急性脑缺血后继发性神经元损伤中起主要作用，与再灌注有关的急性炎症反应促进了继发性损害的发展，缺血再灌注早期由受损神经元释放的细胞因子和黏附因子构成了缺血性损伤向炎症性损伤转变的基础[4]。其中TNF-α、IL-1β与ICAM-1在脑缺血再灌注中起着重要的作用，阻断这些炎性因子在脑缺血过程中的发生与发展，对减轻炎症损伤，进行脑保护非常关键。TNF-α在触发炎症反应中处于中心地位。在脑缺血早期TNF-α分泌或合成的增加是脑梗死形成的主要原因，它具有增加血管内皮细胞的通透性，诱导细胞黏附因子表达等作用[5]。IL-1β也是再灌注脑损伤中起关键作用的一种致炎因子，它可诱导血管内皮细胞表达ICAM-1等粘附分子，而ICAM-1不仅参与炎症过程中白细胞和血脑屏障内皮细胞的黏附，在白细胞的激活、趋化、附壁及渗出等各个阶段都发挥作用[6]。抑制ICAM-1的表达，可以减轻脑缺血再灌注的炎性细胞浸润，减轻神经元的损伤[7，8]。表2各组大鼠不同脑区IL-1β蛋白表达含量比较表3各组大鼠不同脑区ICAM-1蛋白表达含量比较中医认为，痰、淤是人体津液不化或气血、水液代谢失常而形成的病理产物，它不仅是疾病的结果，更会成为重要的致病因素而加重疾病，这与现代医学对溶栓后缺血再灌注过程中产生的代谢产物及继发的炎性反应会加重疾病的认识一致。由此可见，中医的痰淤与现代医学的炎性分泌物密切相关，通过祛痰化淤中药可能有抑制炎性反应、减少炎性分泌物，从而发挥对缺血再灌注脑损伤的保护作用[9]。
       化痰通络法是由天麻、胆南星、半夏、丹参、川芎、地龙、酒军7味中药组成，其中天麻驱除内风，胆南星、半夏化痰，丹参、川芎活血化淤，地龙通络，酒军活血清热，诸药合用，共奏祛风化痰通络、活血通络之功效。本研究显示，在正常组TNF-α、IL-1β、ICAM-1都呈基础表达;模型组TNF-α、IL-1β在缺血后6 h达到高峰，随后有所下降，但直到溶栓后14 d仍然保持较高水平;ICAM-1则在缺血后72 h达到高峰，其后表达在14 d仍维持较高水平。TNF-α与IL-1β的表达要早于ICAM-1。中药组TNF-α水平在治疗后6h下降较尿激酶组明显，治疗后72 h、7 d和14 d时间点比较，TNF-α水平仍有不同程度的下降。中药组与尿激酶组的IL-1β水平在治疗后6h开始下降，中药组在72 h IL-1β水平下降幅度最大，两组IL-1β水平在 6 h、72 h、7 d及14 d的下降水平组间相比具有显著性差异(P<0.05)。ICAM-1表达高峰的缺血时间为72 h，提示溶栓治疗促使黏附分子表达上调，加剧炎性反应。中药组可明显降低缺血脑组织中ICAM-1的含量，与单独应用尿激酶的溶栓治疗相比，具有显著差异(P<0.05)。
       研究结果表明，化痰通络法联合尿激酶溶栓可明显降低溶栓后各时间点缺血脑组织中TNF-α、IL-1β与ICAM-1的含量，说明中药的保护作用可能与通过降低缺血部位脑组织中炎性因子的表达，抑制炎症级联反应损伤，进而减少小胶质细胞活化和单核巨噬细胞在损伤部位积聚等有关，从而对大鼠缺血再灌注脑组织损伤产生保护作用。
       【参考文献】
         　[1]张新江，常丽英，张苏明，等.大鼠自体血栓大脑中动脉闭塞模型的改良[J].卒中与神经疾病，2003，10(1):12.
       
       [2]刘瑜，胡文立，宋爱利，等.大鼠脑血栓模型的实验研究[J].实用医学杂志，2005，21(8):1992.
       
       [3]Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M et a1.Rat middle cerebral artery occlusion: eva- luation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17:472.
       
       [4]李建生，刘敬霞，王冬，等.大黄苷元注射抗大鼠脑缺血损伤炎性级联反应[J].中国药理学通报，2007，23(1):114.
       
       [5]SairanenT， Carpen O， Karjalainen-Lindsberg ML， et al. Evolution of cerebral tumor necrosis factor production during human ischemic stroke[J]. Stroke， 2001， 32:1750.
       
       [6]石兴超，李朝娥.羟乙葛根素对脑缺血再灌注大鼠脑组织ICAM-1表达的影响[J].中原医刊，2007，34(4):46.
       
       [7]Vemuganti R，Dempsey RJ， Bowen KK.Inhibition of intercellular adhesion molecule-1 protein expression by antisense oligonucleotides is neuroprotective after transient middle cerebral artery occlusion in rat[J].Stroke，2004，35:179.
       
       [8]路文革，白宏英，王建平.垂体腺普酸环化酶激活肽对大鼠脑缺血再灌注后细胞间黏附分子表达的影响[J].中国实用神经疾病杂志，2007，10(2):53.
       
       [9]江涛.中医药干预急性脑梗死溶栓疗效的Meta分析[J].中医药临床杂志，2006，18(4):328.