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       【摘要】 
       目的研究乙醇溶剂提取三叶青中总黄酮的最佳工艺条件。方法以乙醇溶液为提取溶剂，采用响应面设计方法，对影响总黄酮提取效果的3个因素乙醇浓度(C)、液料比(R)、提取时间(t)进行中心组合设计试验，并建立数学模型，研究这些因素对黄酮提取率的影响。结果中心组合设计试验建立总黄酮提取率与乙醇浓度(C)、液料比(R)及提取时间(t)间的数学模型显著，R2=0.950 2;最佳的提取工艺条件为28%乙醇(V/V)，液料比22(ml/g)，提取时间2.2 h;经提取次数考察，最佳提取次数为2次。该条件下三叶青总黄酮的提取率为0.30%。结论验证试验结果表明，应用响应面方法优选出的工艺稳定、合理、可行。
       【关键词】  三叶青;总黄酮;响应面优化;提取工艺
       三叶青Radix Tetrastigmae为葡萄科植物三叶崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg的干燥块根,分布于我国浙江,江西,福建,台湾,湖北,广东,广西,四川,贵州及云南等省区[1]，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功能,主要用于治疗高热惊撅、肺炎、哮喘、肝炎、风湿、咽痛、瘰疬,痈疔疮疖等症[2]。在民间三叶青用于肿瘤的治疗有很好的治疗作用并基本无毒。三叶青提取物(ERT)主要含有淀粉、还原糖、黄酮类、甾体类化合物和氨基酸等。在急慢性肝损伤、肝炎、肝癌的现代药理研究中发现，ERT中主要的生物活性物质为槲皮素、山萘酚、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷等黄酮类化合物[3]。响应面分析法(Response Surface Methology，RSM)是近几年发展起来的一种分析方法，其原理是通过一系列确定性试验拟合一个响应面来模拟真实的极限状态曲面, 从而很容易地进行可靠性分析[4]。响应面分析法采用多元二次回归方法作为函数估计的工具, 将多因子试验中因子与指标的相互关系用多项式近拟, 精确地表述因素与响应值之间的关系, 并依此从响应面的形状上找到最佳控制点。可用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对指标的影响，在试验设计与结果表达方面更加优良。本实验选用乙醇回流法进行三叶青总黄酮的提取, 采用响应面法优化提取工艺条件，为有效开发和利用三叶青，充分提取其中所含的黄酮类物质提供指导。
       1材料与仪器
       1.1材料三叶青(宁夏明德饮片厂提供，宁夏药品检验所鉴定)切碎，放入广口甁备用;试药、试剂 芦丁对照品(购于中国药品生物制品检定所);AlCl3 · 6H2O、95%乙醇均为分析纯试剂。
       1.2仪器UV-2550 双光束紫外可见分光光度计(日本岛津) ;AB256-S电子天平(梅特勒-托利多上海有限公司);SHZ-D循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)。
       2方法
       2.1芦丁标准溶液的配制准确称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品5.91 mg，用体积分数为30%的乙醇溶解并定容至25ml量瓶,摇匀,得浓度为0.236 mg/ml的芦丁标准溶液。
       2.2标准曲线的绘制分别准确吸取芦丁标准溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml于25 ml容量瓶，加入0.1 mol/L AlCl3·6H2O 2.0 ml,用30%乙醇定容至刻度，摇匀, 室温放置15 min 后，以试剂空白为参比液,于410 nm 处测定吸光度值。以测得的各比色液的吸光度A对相应的芦丁质量浓度C作标准曲线，得到该曲线的线性回归方程为A = 26.98C + 0.000 4 ,线性范围为0.004 72～0.023 6 mg/ ml，相关系数R = 0.999 5 。
       2.3样品中总黄酮的提取精密称取4.0 g三叶青样品,按提取条件热回流提取一定时间后,趁热过滤,将滤液转至100 ml容量瓶，加提取溶剂定容至刻度，摇匀，作为待测溶液。
       2.4样品中总黄酮的含量测定供试品溶液的制备：准确吸取待测液3 ml于25 ml容量瓶中,按“2.2”项步骤进行测定。根据标准曲线的回归方程导出样品中总黄酮的含量(%)=(A-0.0004)×25.0×10026.98×3.0×m×100%其中: A - 吸光度; m - 称取的样品质量(mg)
       2.5单因素实验以总黄酮含量为考察指标,按“2.3”项方法提取后“2.2”项步骤进行测定。采用单因素法考察药材粒度、提取溶剂、溶剂浓度、料液比、提取时间等因素对三叶青中总黄酮提取率的影响。
       2.6工艺优化方法在单因素试验结果基础上，采用中心组合试验Box-Behnken(BBD)设计方案，选择提取剂乙醇浓度(%)、液料比(ml / g)以及提取时间(h)3个因素，以+1、0、-1 分别代表变量的水平(表1)，进行15个试验点(3个中心点)的响应面分析试验，使用Design-expert software 7.1.3 Tril进行数据分析，求出数学模型，进而对回流提取三叶青中总黄酮的影响因素进行研究和条件优化。表1中心组合试验Box-Behnken方案设计的因素和水平编码值表
       3结果与分析
       3.1单因素实验
       3.1.1提取溶剂的选择黄酮类化合物无论是游离的黄酮苷元还是黄酮苷都易溶于乙醇、甲醇、水等极性大的溶剂中。考虑到甲醇的毒性，本实验以水和不同浓度的乙醇回流提取,结果以水为提取剂提取率较低。因此，本实验选择乙醇溶液作为提取溶剂。
       3.1.2粒度的选择考察不同粒度对总黄酮提取率的影响，以原料(未粉碎) 、未过1号筛、过1号未过2号筛、过2号筛4种粒度进行回流提取。由于三叶青含有较多的淀粉、黏液质,粒度较小时在加热情况下容易使淀粉糊化，细胞内大量的黏液质渗出，不利于其它成分的浸出，且过滤困难。而未粉碎药材总黄酮提取率低于切碎未过1号筛者，因此本实验粒度选用未过1号筛。
       3.2响应面试验结果与分析
       3.2.1提取剂浓度、液料比和提取时间的优化试验结果单因素试验结果表明，在10~90%范围内，乙醇体积分数为30%时提取率最高;液料比在5~25 ml/g 范围内，20 ml/g 时提取率最高。提取时间在0.5~3 h范围内，3 h时提取率最高，但提取时间超过2 h，提取率增加速度趋缓。以乙醇溶液为提取溶剂，提取条件的响应面分析试验设计及结果见表2。试验号1，2，3，4，5，6，7，9，10，11，14，15 是析因试验，试验号8，12，13 是中心试验。其中析因点为自变量取值在C、R、t所构成的三维顶点;零点为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计实验误差。表2BBD设计和实验结果
       3.2.2回归分析对试验数据进行响应曲面回归分析。结果见表3。表3实验数据的二次响应面模型和回归分析当“Prob >F”值小于0.05 时，即表示该项指标显著，而对三叶青总黄酮提取率方差分析(表3)结果表明，对总黄酮提取率所建立的回归模型是显著的。并且该模型的R2=0.950 2，说明此模型与实际试验拟合较好，试验失拟项小，因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。
       3.2.3拟合模型的建立以供试液的吸光度(A)为响应值，经回归拟合后，各因子与响应值的回归方程为：A=-0.584 53+8.356 25E-003C+0.037 208R+0.330 58t-6.000 00E-005C × R-1.500 00E-004 C t+2.100 00E-003Rt-1.223 96E-004C2-9.283 33E-004×R2-0.086 833t2
       3.2.4响应面(RSM)分析响应曲面图是响应值对各试验因子C、R、t所构成的响应面图形，从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。本实验根据回归方程进行不同因子的响应面分析。结果图1~3。通过软件分析，得到热回流提取三叶青总黄酮的最佳条件为乙醇浓度28%，液料比为22 ml/g，提取时间为2.2 h。在此条件下，总黄酮单次提取供液吸光度的理论预测值为0.286。
       3.2.5验证性试验为检验RSM法的可靠性及稳定性，精密称取5份药材样品按上述最佳提取工艺进行验证试验,操作方法同前述。 结果供试液的吸光度分别0.289，0.281，0.274，0.285，0.291，平均值为0.284，单次提取总黄酮的提取率为0.22%，RSD=2.4%(n=5)。与理论预测值比较误差在3%以内。因此，采用RSM法优化得到的提取条件参数准确可靠，具有实用价值。图1乙醇浓度和液料比对三叶青总黄酮提取影响的曲面图和剖面图图2乙醇浓度和提取时间对三叶青总黄酮提取影响的曲面图和剖面图图3液料比和提取时间对三叶青总黄酮提取影响的曲面图和剖面图
       3.2.6提取次数的考察在已优化的单次提取条件下,考察不同提取次数对总黄酮提取率的影响。结果如图4所示,提取2次后总黄酮的提取率为0.30%，已提出总黄酮的88% ,从生产工艺的角度考虑,选用提取次数为2次。图4提取次数对三叶青总黄酮提取率的影响
       4讨论
       本试验所用三叶青中总黄酮的含量测定方法经方法学考察，精密度、稳定性及加样回收试验均符合规定。三叶青总黄酮含量测定方法选用Al(NO3 ) 3 - NaNO2 - NaOH 显色后,明显生成红色絮状沉淀，此法不宜采用。而用AlCl3显色后，芦丁标准液的λmax = 410 nm，样品溶液的λmax = 400 ～410 nm，故选择AlCl3显色后410 nm 波长处测定吸光度。以乙醇溶液为提取溶剂，采用热回流法提取三叶青中的总黄酮，考察了乙醇浓度、液料比、提取时间等对三叶青总黄酮得率的影响,并结合BBD实验设计得到了最优提取工艺参数: 乙醇浓度为28%，液料比为22 ml/g ,提取时间为2.2 h，提取2次。在此条件下, 三叶青总黄酮提取率为0.30 %。经验证试验证明用该工艺提取三叶青总黄酮工艺简单、稳定性好。本次实验优选出来的实验条件,对今后开发利用三叶青中的总黄酮具有一定的指导意义。
       【参考文献】
         　[1]中国医学科学院药物研究所. 中药志. 第二册[M]. 北京:人民卫生出版社,1984：219.
       
       [2]江苏新医学院.中药大辞典(下册) [M] .上海:上海人民出版社 ,1977：2123.
       
       [3]刘东，鞠建华，林耕，等.三叶崖爬藤中的新黄酮碳甙[J ] .植物学报 ,2002 ,44 (2) :227.
       
       [4]R.V. Muralidhar, R.R. Chirumamila. A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon sources [J] . Biochemical Engineering Journal, 2001, 9 ( 1) : 17.