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       【摘要】 
       目的建立山东省两种生境下3个不同产地的单叶蔓荆子药材的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)指纹图谱，探讨蔓荆子种内变异规律。方法蛋白质、过氧化物酶同工酶PAGE指纹图谱分析。结果两种生境3个产地的单叶蔓荆子的Pro-PAGE、POD-PAGE图谱无显著差异。结论两种生态环境对蔓荆子遗传特征无影响。
       【关键词】  蔓荆子;聚丙烯酰胺凝胶电泳;指纹图谱
       蔓荆子为马鞭草科植物单叶蔓荆Vitex trifolia L.var.simpllicifolia Cham.或蔓荆Vitex trifolia L.的干燥成熟果实[1]，具有疏散风热、祛风胜湿、清利头目的功效。山东是单叶蔓荆的主产区。目前我省单叶蔓荆的生境主要有：海岸沙滩、河岸沙滩、盐碱地。实验研究[2，3]表明环境对蔓荆子有效成分及含量影响较大。为进一步探讨环境与蔓荆子种内变异的关系，揭示其种内变异的规律，本研究采 用蛋白质和过氧化物酶同工酶电泳两种生化标记方法对来源于山东省不同生境下的单叶蔓荆子进行了分析研究，以期为种质资源的收集和药效成分研究提供参考。
       1仪器与材料
       1.1仪器DYY-Ⅲ型多用电泳仪，DYY-Ⅲ28D型垂直电泳槽，EDAS-290凝胶成像紫外分析仪，LD5-2A低温离心机，LGR16-W型高速冷冻离心机，FA1104型电子天平，SHZ-3型循环水真空泵，真空干燥器，KQ-50型超声波清洗器等。
       1.2 试剂三羟甲基氨基甲烷，丙烯酰胺，过硫酸铵，N,N-亚甲基双丙烯酰胺，甘氨酸，40%蔗糖溶液，考马斯亮蓝R250，醋酸联苯胺，四甲基乙二胺，溴酚蓝等，所用试剂均为分析纯。
       1.3 实验材料 新鲜单叶蔓荆Vitex trifolia Lin.Var.simplicifolia果实采于威海海岸沙滩、牟平海岸沙滩、大汶河河岸沙滩，冷冻保鲜。
       2方法
       2.1 蛋白质PAGE指纹图谱分析
       2.1.1 样品液制备称取新鲜蔓荆子药材约1.0 g，加入2 ml稀释4倍的浓缩胶缓冲液(pH8.9)，超声提取30 min，3 500 r/min离心15 min，取上清液加等体积的40%蔗糖溶液，作为供试品溶液，4 ℃冰箱内冷藏，备用。
       2.1.2 蛋白质电泳参照文献[4]方法安装好电泳槽，凝胶板参照文献[5]方法制备。用微量进样器吸取样品提取液20 μl,缓缓注入样品槽底部,在负极槽电极缓冲液中加入1滴溴酚蓝指示剂示踪,将电泳槽正负极与电泳仪正负极相连,电泳开始时控制电流15 mA,样品进入分离胶后,电流调整至25 mA。待示踪指示剂行至距琼脂层约1 cm时,关闭电源,停止电泳。整个过程约需3 h,为防止温度过高,电泳在冰箱内进行。
       2.1.3 染色与保存打开电泳槽，取出胶板，标记前沿。将凝胶板浸于考马斯亮蓝染色液内，在恒温培养箱中37 ℃染色1～2 h，至谱带清晰。胶板染色后，用蒸馏水洗去凝胶表面附着的染料，再将胶板浸于脱色液中脱色，直至谱带背景清晰。放入7%醋酸液中长期保存。
       2.1.4 蛋白质指纹图谱分析蛋白质PAGE图谱见图1。胶板用EDAS-290凝胶成像紫外分析仪成像分析。以泳道中各谱带所在位置Pos为横坐标，谱带透光率OD为纵坐标作图，绘制各谱带的透光率图并分析谱带相似度，结果见图2。1，2：威海蔓荆子;3，4：大汶河蔓荆子;5，6，7，8：牟平蔓荆子图1蛋白质电泳指纹图谱Lane 1 威海蔓荆子Lane 2、3 大汶河蔓荆子Lane 4 牟平蔓荆子图2蛋白质谱带相似度分析图谱
       2.2 过氧化物酶(POD)同工酶电泳
       2.2.1 样品液制备 称取新鲜蔓荆子样品1 g，冰浴研磨，加入1 ml电极缓冲液(pH 8.3)，冰浴超声提取30 min，8 000 r/min，0℃离心15 min，上清液加等体积40%蔗糖溶液混匀，置冰箱内冷藏，备用。
       2.2.2 电泳与染色电泳方法同上。取出胶板,标记前沿。将胶板浸于醋酸联苯胺液内, 加2～3滴30%双氧水，常温下染色，很快出现蓝色谱带，不久变为棕红色，弃去染色液，凝胶板用蒸馏水冲洗后保存于7%的醋酸溶液中。
       2.2.3 谱带分析 同工酶电泳谱带用EDAS-290凝胶成像紫外分析仪成像分析。结果见图3~4。1，2：威海蔓荆子;3，4：大汶河蔓荆子;5，6，7，8：牟平蔓荆子图3同工酶电泳指纹图谱
       3结果
       由图1可以看出3个不同产地单叶蔓荆子的蛋白质PAGE指纹图谱无显著性差异：谱带位置、条数、带型无差异，说明含有相同类型的蛋白质。牟平蔓荆子谱带清晰度低于威海、大汶河样品，可能与样品有效成分含量不同有关。由图2可看出：以威海蔓荆子蛋白质电泳图谱为标准，威海蔓荆子与牟平蔓荆子相似度为91.01%，而大汶河蔓荆子与威海蔓荆子相似度分别为89.86%，88.59%。可知生长在两海滩沙地的蔓荆子相似度更大。Lane 1 威海蔓荆子;Lane 2、3 大汶蔓荆子;Lane 4 牟平蔓荆子图4同工酶谱带相似度分析图谱由图3可知3个不同产地的蔓荆子过氧化物酶同工酶电泳图谱共有6条谱带，谱带位置、带型无差异，说明3样品含有相同类型的过氧化物酶。牟平蔓荆子谱带清晰度低于威海、大汶河样品，可能是因为样品有效成分含量不同。由图4可知：威海蔓荆子与牟平蔓荆子相似度为97.48%，而大汶河蔓荆子与威海蔓荆子相似度分别为91.78%，90.57%。可知生长在海滩的蔓荆子中含有的同工酶含量更相近。
       4讨论
       3种蔓荆子均来源于马鞭草科植物单叶蔓荆的果实，外观性状上很难区分，蛋白质电泳指纹图谱、过氧化物酶同工酶指纹图谱谱带条数、位置均无显著差异也表明了样品间密切的亲缘关系。蛋白质是植物基因表达的产物，不同的品种、杂交种具有不同的蛋白质谱带模式[6]，同工酶能准确反应基因的存在状况和表达规律。用Pro-PAGE电泳指纹图谱可以有效地鉴别植物的品种，POD-PAGE指纹图谱可以鉴别不同产地的药材。由蛋白质电泳、过氧化物酶同工酶电泳结果初步可知两种不同生境下的单叶蔓荆子所含蛋白质、过氧化物酶同工酶种类无差异。
       【参考文献】
         　[1]国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社,2005：252.
       
       [2]彭艳丽，刘红燕，张炳桢.山东不同产地单叶蔓荆子挥发油GC-MS分析[J].山东中医药大学学报，2005，29(2)：146.
       
       [3]徐榕青，林玉霖，林文津，等.不同产地蔓荆子生药材中总黄酮含量的比较研究[J].中药材，2008，31(2)：243.
       
       [4]顾一珠，马君一，李明，等.玫瑰花聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别研究[J].药物分析杂志，2009，29(5)：819.
       
       [5]石俊英.中药电泳鉴别法及其在药用植物、动物中的应用研究[J].山东中医学院学报，1995，19(2)：74.
       
       [6]石俊英，巩丽丽，张会敏.不同产地桔梗的聚丙烯酰胺凝胶电泳指纹图谱鉴别研究[J].中国药学杂志，2007，42(19)：1462.