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       【摘要】 
       目的探讨蛭龙活血通淤胶囊对大鼠急性脑梗塞缺血/再灌注后神经细胞凋亡及相关基因表达的影响。方法采用线拴法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，将40只雄性SD大鼠随机分为观察组(蛭龙活血通淤胶囊)10例，对照组(步长脑心通)10例、模型组10例及假手术组10例，用药7 d，应用TUNEL法和免疫组织化学法检测各组大鼠脑组织凋亡细胞的分布及bcl-2、Caspase-3蛋白的表达。结果实验证实了急性脑梗塞缺血再灌注损伤凋亡细胞的存在，模型组脑神经细胞凋亡数量显著高于假手术组(P<0.01)，蛭龙活血通淤组与步长脑心通药物干预组与模型组相比细胞凋亡指数显著下降(P<0.01)，但蛭龙活血通淤组与步长脑心通药物干预组二者比较无明显差异(P>0.05)。模型组脑神经细胞bc1-2和Caspase-3基因蛋白表达均显著高于假手术组(P<0.01)，与模型组相比，蛭龙活血通淤组与脑心通组明显上调bc1-2的基因表达(P<0.01)，明显抑制Caspase-3基因蛋白表达(P<0.01)， 蛭龙活血通淤组与步长脑心通药物干预组间比较无明显差异(P>0.05)。结论蛭龙活血通淤胶囊对急性脑梗塞引起的神经细胞凋亡有明显抑制作用。其机制可能与上调bcl-2，抑制Caspase-3有关。
       【关键词】  蛭龙活血通淤胶囊;急性脑梗塞;缺血性中风;细胞凋亡;bcl-2;caspas-3
       脑梗塞是临床常见病、多发病，其发病率、死亡率和致残率均较高[1]，因而其治疗受到国内外医药界广泛关注，而“蛭龙活血通淤胶囊”是泸州医学院附属中医院心脑内科杨思进教授针对中风风痰淤阻的主要临床证型创制的纯中药制剂，主要功能为益气活血，化淤通络，主要用于缺血性脑血管疾病、冠心病、静脉血栓性疾病等的防治，被临床运用多年起到了很好的临床疗效。本文通过动物实验， 探讨蛭龙活血通淤胶囊对急性脑缺血缺血再灌注损伤的抗凋亡作用机制， 为临床治疗提供理论依据。
       1材料与仪器
       1.1动物及分组健康雄性SD大鼠40只，体质量250～300 g，皮肤光滑润泽，呼吸道通畅，属清洁级，由泸州医学院动物实验中心提供。将大鼠用随机数字表法分为4组。(蛭龙活血通瘀胶囊观察组 、步长脑心通对照组、模型组、假手术组)。每组10只，各组动物间鼠龄及体质量无差异性。
       1.2药品和试剂蛭龙活血通淤胶囊，由泸州医学院附属中医医院制剂室提供，批号20061213;步长脑心通胶囊，咸阳步长制药有限公司产品，批号061212;TUNEL试剂盒由武汉博士德公司提供;Caspase-3试剂盒与bcl-2试剂盒均由博奥森公司提供。
       1.3仪器JSJ-1组织脱水机;BMJ-1生物组织包理机;ZDJ-1型展片机;KDJ-1型烤片机均由天津航空机电公司提供，Leica切片机(德国)，HIMAS-2000多媒体彩色病理图文分析系统(同济医科大学)。
       2方法
       2.1动物模型参照Zea longa等的方法，大鼠造模前禁食不禁水24 h。室温条件下，大鼠称重后，用2%戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔麻醉后，仰卧固定在手术台上，颈部备皮，常规消毒后行正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉((ICA)和颈外动脉(ECA)。在近心端结扎CCA，远心端挂线备用。在CCA分叉处结扎ECA;ICA近分叉处备线并打一活结，ICA远端用微动脉夹夹闭;距CCA分叉0.5 cm处将CCA剪一小口，插入直径0.2 mm的线栓，收紧备线，打开动脉夹，栓线进入ICA，轻柔推进，当线端进入18～21 mm时可感到有一定阻力即停止推送。此时栓线头端正好位于大脑中动脉(MCA)起始部，阻断了MCA的血流。缺血1 h后，拔出线栓，扎紧备线，固定纤维缝合，切口局部以甲硝唑冲洗消毒，每只大鼠注射1 ml(4万u)庆大霉素以预防感染。假手术组除不插入线栓外，其余步骤同模型组。术中体温用烤灯维持在37～37.5℃。正常对照组无任何处理。造模后的动物在自然苏醒后，出现右侧Horner征，提尾左前肢内收屈曲，爬行时向左侧划圈者为手术成功的标志。
       2.2药物干预大鼠于缺血1 h再灌注24 h后给予蛭龙活血通瘀胶囊灌胃2 g/(kg·d)，连续7 d。步长脑心通组给予步长脑心通灌胃，2 g/(kg·d)，连续7 d。假手术组、模型组大鼠均给相同体积的蒸馏水灌胃。
       2.3神经功能缺损评分进行两次神经功能缺损评分，于造模成功后第1天进行神经功能缺损评分，治疗、观察7 d后再进行1次。按Bederson评分标准评分，0级(0分)：无神经功能障碍;1级(1分)：提大鼠尾，见瘫痪侧前肢回收屈曲不能正常伸向地面;2级(2分)：除1级体征外，向瘫痪侧推时感阻力较对侧明显降低;3级(3分)：除以上体征外，大鼠爬行时向瘫痪侧旋转。
       2.4免疫组化每组随机取8只大鼠行免疫组化。
       2.4.1组织灌注与固定简要手术步骤如下：6%的水合氯醛(5 ml/kg)腹腔注射麻醉。经心脏灌注肝素化生理盐水(37℃)10 min，然后4%的多聚甲醛350 ml 持续灌注30 min。取脑后用4%的多聚甲醛后固定6 h行梯度脱水与石蜡包埋。
       2.4.2神经细胞凋亡及Bcl-2与Caspase-3基因表达测定采用原位末端标记法(TUNEL)检测伤侧皮层、海马区神经细胞凋亡情况，采用免疫组化法测定Caspase-3的表达，应用图像分析处理系统对染色强度的灰度进行定量分析。
       2.4.3计算机图像分析将切片于光镜下放大400倍，通过计算机图象分析仪，每张切片随机选择10个视野，测定阳性染色的平均光密度与阳性细胞百分比(指阳性细胞占视野中所有细胞数的百分比)，分别计算：①细胞凋亡指数(AI)=(%)=平均光密度×阳性细胞百分比×100;②蛋白阳性表达指数(PEI)=(%)=平均光密度×阳性细胞百分比×100%。
       2.5统计学处理计量资料以±s表示，使用SPSS13.0软件进行统计学处理，组间差异采用方差分析，两两对比采用t检验。取P<0.05作为显著性差异水平。
       3结果
       3.1神经功能缺损程度治疗后神经功能缺失评分假手术组为0分，蛭龙活血通淤胶囊治疗组为(1.78±1.03)分，步长脑心通治疗组为(1.80±1.15)分，两组均显著低于模型组的(2.90±1.10)分(0.01
       3.2组织病理学变化光镜下假手术组大鼠皮层各层细胞排列整齐，神经元结构完整，神经基质无水肿，基底神经节区神经元结构正常，神经纤维无损坏，模型组大鼠病理改变为神经元结构模糊，胞体肿胀，胞核淡染，核固缩，尼氏小体减少或消失等变化;蛭龙活血通瘀治疗组与步长脑心通对照组见大脑皮质锥体细胞和脑实质神经细胞结构清楚，核固缩、核溶解程度较局灶脑缺血对照组明显减轻，病变范围明显缩小。
       3.3凋亡细胞和Bcl-2、Caspase-3蛋白表达检测结果光镜下TUNEL染色阳性的凋亡细胞为圆形或椭圆形，细胞核或胞浆中有棕色颗粒，核染色质浓聚呈边聚观象，似月牙形，有时可见细胞膜皱褶，以及芽生形成膜包裹的凋亡小体。阳性细胞呈簇状或散在分布于梗塞灶边缘区域。假手术组脑组织TUNEL染色只有零星的细胞凋亡，而模型组凋亡细胞略有增多，蛭龙活血通淤治疗组与步长脑心通对照组较模型组凋亡细胞明显减少(P<0.01)。光镜下Bcl-2阳性细胞核膜和胞浆呈棕黄色。假手术组可见少量表达，模型组较假手术组增多(P<0.01)，多分布在缺血周围区域，而病灶中心未见阳性细胞。蛭龙活血通淤治疗组与步长脑心通对照组表达最多，与模型组及假手术组比较有显著性差异(P<0.01)。光镜下Caspase-3阳性细胞胞浆、胞核均着色，呈均匀弥漫棕黄色染色，多分布于缺血周围区域，蛭龙活血通淤治疗组与步长脑心通对照组Caspase-3阳性细胞的表达均明显少于模型组(P<0.01)。结果见表1。　表1各组神经功能评分及神经细胞凋亡指数
       4讨论
       近年来细胞凋亡与脑梗塞的关系越来越受到人们的重视。有研究表明缺血性脑损伤引起的细胞死亡有凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)两条途径[2]，坏死发生在脑缺血较早期的缺血中心区，而凋亡多发生在脑缺血后的半暗区。脑梗塞发生、发展过程与细胞凋亡的发生机制目前尚未清楚。目前研究较多的有Bcl-2家族和Caspase家族[3，4]，其与细胞凋亡过程密切相关，研究表明抑制神经细胞凋亡就可能减少脑缺血后迟发性神经元损伤，从而抢救缺血后半暗区，就有可能阻止脑梗塞范围扩大，减轻脑损害，保护脑组织。
       大脑中动脉闭塞(MCAO)模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型[5]。其中线栓法MCAO模型，具有不开颅、效果肯定且可准确控制缺血及再灌注时间的优点，便于分析神经元对缺血的敏感性、耐受性，及研究再灌注损害和治疗时间窗的选择，本实验研究亦采用此法的改良方法[6]制作大鼠缺血再灌注模型。本实验通过DNA末端标记法(TUNEL)证实了急性脑梗塞再灌注过程中凋亡细胞的存在，研究结果表明蛭龙活血通淤胶囊可有效促进相关基因Bcl-2，抑制相关蛋白Caspase-3的表达，对脑神经细胞凋亡有明显抑制作用，减轻脑神经细胞损伤，对缺血再灌注脑组织有保护作用。同时HE染色显示模型组缺血区脑神经细胞广泛坏死，再灌注损伤区形成软化灶，灶内组织溶解，正常结构消失，细胞多为小核深染的细胞。软化灶周边细胞相对正常。蛭龙活血通淤胶囊组与步长脑心通组缺血软化灶相对模型组则较小。
       蛭龙活血通淤胶囊是以黄芪、水蛭、地龙、桂枝等药为主而成的纯中药制剂，现代药理研究证实黄芪能明显扩张脑血管，改善微循环，保护红细胞变形能力、促进血液流动、减轻血栓形成，保护脑组织缩小梗塞范围，抑制血小板黏附聚集及释放，促进神经元生长作用[7]。水蛭则可以抗血栓[8];抑制血小板聚集[9];降低血脂和改善血液流变学[10];减轻脑水肿[11]。地龙[12]可对体内的凝血系统和纤溶系统具有广泛的影响，使体外的血栓形成时间延长，既抗凝又不影响止血，有利于血栓的防治。本研究结果阐明蛭龙活血通淤胶囊具有减轻脑组织水肿，抑制神经细胞的凋亡及坏死等脑缺血保护作用，为临床脑血管病的防治提供理论依据，当然，其作为复方制剂治疗脑梗塞，其具体机制更为复杂，尚待进一步研究。
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