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       【摘要】 
       目的研究超声提取飞廉悬浮细胞中总黄酮的最佳工艺。方法以总黄酮含量为指标,利用正交实验设计考察提取工艺的最佳组合。结果最佳工艺为以60%乙醇为提取剂,料液比1∶20 ( g /ml)，提取温度为60℃，提取时间30 min。结论最佳提取条件下，飞廉细胞中的总黄酮含量为8.73 mg /g。
       【关键词】  超声提取;飞廉悬浮细胞;总黄酮;正交实验
       飞廉Carduus crispus L，是飞廉属植物，为二年生或多年生草本[1]，遍布全国各地，资源非常丰富。到目前为止已从飞廉属不同植物中分离得到黄酮、木脂素、香豆素、生物碱、三菇、单菇、苯丙素，以及幽醇等活性成分[2]，主要用于治疗风热感冒，头风晕眩，风热痹痛，皮肤瘙痒，尿路感染，乳糜尿，尿血带下，跌打瘀肿，疗疮肿毒，烫火伤等[3]。悬浮培养药用植物细胞可以代替药用植株做为活性成分的提取材料，具有生长周期短，活性成分含量稳定，可以人为控制，并且可以大规模培养的优点[4]。虽然飞廉属植物具有很好的药用价值，但到目前为止，与之相关的研究报道还很少见到，现有的几篇文献也集中在分析该属植物的主要化学成分上[1～3]。前期实验发现，黄酮类物质为飞廉的主要活性成分之一，具有很好的生物活性。为了更好地开发利用它的药用价值，我们以总黄酮含量为考察指标,对飞廉悬浮细胞中总黄酮提取工艺进行了优化。
       1材料与仪器
       1.1原料飞廉植株由杭州市药物种植场提供，飞廉愈伤组织由浙江工商大学食品和生物工程学院细胞工程实验室诱导选育。将愈伤细胞转接到MS液体培养基上(MS+1×10-5 mol/L，NAA+2×10-6 mol/L，BA+30g/L 蔗糖，pH5.8，121℃灭菌20 min)，于25℃，110 r/min下黑暗振荡培养,接种量为60 g /L，建立飞廉悬浮细胞系。实验所用的飞廉悬浮细胞已经过多次继代培养，具有比较稳定的形态特征和生长速率。
       1.2试剂与仪器芦丁对照品 ( Sigma)，UV-2100型紫外可见分光光度仪(尤尼柯仪器有限公司)，SHBⅢ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，电热鼓风干燥箱101A-2型(上海市实验仪器总厂)，AB204-N电子分析天平(梅特勒.托利多仪器有限公司), THZ-D台式恒温振荡器(太仓市实验设备厂)，SW-CJ-1F型净化工作台(苏州净化设备厂)，KQ3200DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
       2方法与结果
       2.1分析方法
       2.1.1正交实验设计根据预实验结果，选择乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间为实验因素，采用L9(34 )正交表进行实验,设计的因素水平见表1，以飞廉细胞中总黄酮的含量作为评价指标。
       2.1.2对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品5 mg，溶于50 ml 60%的乙醇中，配成0.1 mg/mL母液。取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml母液于10 ml容量瓶中，补加60%的乙醇溶液至5 ml，混匀。加5%的亚硝酸钠0.4 ml，混匀，放置6 min，再加10%的硝酸铝0.4 ml，混匀，放置6 min。加4%的氢氧化钠4 ml， 最后加60%的乙醇至刻度线，放置15 min后，510 nm处测其吸光度值。测得其标准曲线为Y=0.066 5X+0.000 7 (R=0.999 8)，其中X为吸光度值，Y为单位体积黄酮含量。表1因素水平
       2.1.3样品溶液的制备和测定将培养了12 d的飞廉细胞抽滤至不滴水后，放入60℃ 干燥箱烘干约36 h至恒重。将干细胞样品研磨，取0.5 g干细胞粉， 按正交表的设计条件进行超声提取，提取次数为2次，提取液过滤，合并滤液最后定容至25 ml，做为待测液。取1 ml待测液于10 ml容量瓶中，按“2.1.2”的步骤依次加入其它试剂，在510 nm处测得吸光值。按下式计算样品总黄酮含量：X=C×V/m×V1/V2。其中：X-为黄酮含量(mg/g)，以芦丁计;C-根据吸光度得到的样品总黄酮浓度(mg/ml);m-处理样品的质量(g);V-测吸光度时所稀释的容量瓶体积，这里为10 ml;V1-样品处理液的总体积(ml)，这里为25 ml;V2-测定时吸取样品处理液的体积(ml)。
       2.2正交实验结果正交实验结果极差越大，因素影响越大。由表2可知，影响悬浮培养飞廉细胞中总黄酮提取的因素主次顺序为：乙醇浓度(A) >料液比(B) >提取温度(C) >提取时间(D)，飞廉细胞中总黄酮超声提取的最佳工艺条件为：A2B3C1D2，即乙醇浓度为60%，料液比1∶20，提取温度为60℃，提取时间为30 min。正交实验的方差分析(见表3)结果显示，乙醇浓度对飞廉细胞中总黄酮的提取有极显著性影响，料液比对黄酮提取也有较大的影响，提取时间和温度在此实验范围内没有显著差异，对测定结果的影响较小，与直观分析结果(见表2)相吻合。表2正交实验结果表3正交实验方差分析结果
       3结论
       超声波提取法是近年来《中国药典》收载应用较多的一种样品处理方法，具有提取效率高、处理时间短、操作简便等优点[5]。本文首次报道了超声技术在飞廉悬浮细胞总黄酮提取中的应用，并通过正交实验，优化了飞廉细胞中总黄酮的提取工艺,正交实验结果表明超声提取飞廉细胞总黄酮的最佳工艺条件为:乙醇浓度60%，料液比1∶20，提取温度60℃，提取时间30 min。在该最佳超声提取工艺条件下，总黄酮含量达到8.73 mg/g。本研究为更好地开发利用飞廉属植物中黄酮类化合物奠定了良好的基础。
       【参考文献】
         　[1]王玉华，温爱平，杨来秀，等.蒙药材飞廉的实验研究[J].内蒙古医学院学报，2009，31(3):219.
       
       [2]戴静秋.西北风毛菊、蒙古芯芭、丝毛飞廉三种药用植物化学成分和生物活性的研究[D].兰州:兰州大学，2002 :90.
       
       [3]张庆英.生藤和飞廉化学成分及生物活性研究[D]. 北京:北京医科大学，2000:85.
       
       [4]黄璐琳，胡尚钦，杨晓.药用植物生物工程研究进展Ⅰ.组织和细胞培养研究[J].中草药，2006，37(4):488.
       
       [5]牛立新，李章念，李红卷，等.超声波提取卷丹鳞茎中总黄酮研究[J].中药材，2007，30(1):852.