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       【摘要】 
       目的探讨五味子水提液对D-半乳糖所致衰老神经细胞的保护作用。方法将原代培养的大鼠乳鼠大脑神经细胞培养7 d后，分为正常对照组、模型组(D-gal组);实验组(8 g/L D-gal+750 μg/ml五味子水提液，8 g/L D-gal + 500 μg/ml五味子水提液，8 g/L D-gal + 250 μg/ml五味子水提液);药物对照组(8 g/L D-gal + 500 μg/ml人参皂苷)，作用24 h后，电镜观察各组细胞超微结构的变化，细胞化学染色观察各组培养细胞内Nissl体和脂褐素(LPF)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、酸性磷酸酶(ACP)的活性变化。结果五味子水提液能恢复D-半乳糖所致损伤的乳鼠大脑培养神经的超微结构，抑制Nissl体的减少和LPF的沉积，提高神经细胞内SDH活性及降低ACP活性。结论五味子水提液对D-半乳糖所致衰老神经细胞的保护作用。
       【关键词】  五味子;D-半乳糖;神经细胞
       五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(TurcZ)Bail 的干燥成熟果实，其果实入药，味酸性温，入肺、肾经，有敛肺、滋肾、止汗、生津、止泻、涩精之功效[1]。中医临床常用于神经衰弱等证，具有兴奋中枢神经系统、兴奋脊髓、提高大脑皮层的调节作用[2～4]，本实验探讨了五味子水提液对大脑神经细胞的抗衰老作用，为五味子的进一步开发应用提供了实验和理论依据。
       1材料与仪器
       1.1动物SD大鼠乳鼠(8 d龄)双侧大脑半球，动物由延边大学医学部实验动物科提供。
       1.2药物五味子水提液(由延边大学药学院提取制成)，用RPMI-1640培养基配成750，500，250 μg /ml;人参皂苷(吉林省靖宇县黄封参药业公司产品)，用RPMI-1640培养基配成500 μg/ml。RPMI-1640培养基(GIBAO产品);胰蛋白酶(美国DIFCO产品);D-半乳糖(上海试剂二厂产品)。
       1.3仪器OLYMPUS倒置显微镜购自日本;JEM-1200EX型透射电子显微镜购自日本;PD-2000真彩色病理细胞图像分析仪购自北京天地百年科技公司。
       2方法
       2.1原代单层神经细胞培养与分组无菌条件下取SD大鼠乳鼠(8 d龄)双侧大脑半球，用含20%小牛血清的RPMI-1640培养基制成细胞悬液，以1×106/ml的密度接种。放置37℃ CO2 培养箱中培养，培养至第7天，选生长良好的细胞随机分为6组。正常组、模型组(加入8g/L D-gal)、实验组(8 g/L D-gal+750 五味子水提液，8 g/L D-gal+500 μg/ml五味子水提液，8 g/L D-gal+250 μg/ml五味子水提液);药物对照组(8 g/L D-gal+500 μg/ml人参皂苷);作用24 h后，进行实验观察。
       2.2透射电镜观察取生长良好的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以2 000 r/min离心15 min，收集细胞用3%戊二醛和1%锇酸双重固定，梯度丙酮脱水，Epon815、812混合树酯包埋，超薄切片，电子染色，JEM-1200EX型透射电子显微镜观察，拍照。
       2.3细胞化学染色[5，6]Nissl体染色：采用甲苯胺蓝染色法;LPF：采用Glenner氏联合反应法;SDH：采用亚铁氰化钾法;ACP：采用Gomori法进行染色。
       3结果
       3.1透射电镜观察模型组细胞膜被破坏，核膜膜褶增多，各种细胞器均有减少：粗面内质网脱颗粒;高尔基体结构被破坏;线粒体膨胀呈空泡状，嵴断裂，胞质内可见大量脂滴沉积;实验组和药物对照组的各种细胞器超微形态结构均得到明显恢复。结果见图1～2。
       3.2细胞化学染色
       3.2.1Nissl体染色模型组胞质内蓝紫色Nissl体颗粒减少。药物组和药物对照组的Nissl体与模型组比较，均有明显变化。结果见图3～4。
       3.2.2LPF染色模型组LPF明显增多，药物组和药物对照组的LPF含量均明显减少。结果见图5～6。图1模型组图2实验组(750 μg/ml)图3模型组(400×)图4实验组(750 μg/ml，400×)图5模型组(400×)图6实验组(750 μg/ml，400×)
       3.2.3SDH染色模型组SDH酶活性呈弱阳性，二甲臜沉淀颗粒染色浅，颗粒减少。实验组和药物对照组的SDH酶活性均呈强阳性，染色深。结果见图7～8。图7模型组(400×)图8实验组(750 μg/ml，400×)
       3.2.4ACP染色模型组ACP活性呈强阳性、酶颗粒常聚集成团块状，染色深。实验组和药物对照组的ACP活性均呈弱阳性，酶颗粒染色较浅。结果见图9～10。
       4讨论
       现代自由基医学研究表明，生物体的衰老与自由基代谢失衡有关。机体通过酶系统或非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。图9模型组(400×)图10实验组(750 μg/ml，400×)本实验中D-gal作用于培养神经细胞后，在脂质过氧化过程中产生多种活泼自由基，攻击细胞中的蛋白质、酶和其它成分，使其发生自由基反应而抑制蛋白质的功能，降低酶的活性。结果导致细胞膜正常结构和完整性的破坏，胞质内各种细胞器受损。本实验结果表明，实验组神经细胞均生长良好，细胞存活率明显高于D-gal组;细胞的超微结构损伤轻;细胞内Nissl体含量高，LPF沉积少;SDH活性呈强阳性，ACPase活性呈弱阳性。提示五味子可较好地阻碍自由基对细胞膜性结构的作用，抑制脂质过氧化反应而抑制LPF的沉积;可较好地稳定细胞的膜性结构，降低溶酶体膜的通透性，阻止ACP水解酶释放，将细胞内环境趋于稳定，减少神经元的破坏损伤;可较好地保护线粒体的结构和功能，增强SDH的活性而增加细胞的能量供应，提高细胞的活力。本实验为研究五味子的抗衰老作用机理提供了实验数据。
       【参考文献】
         　[1]李时珍. 本草纲目[M]. 北京：人民卫生出版社，1975：153.
       
       [2]闫舒，仰榴青，赵婷，等. 五味子多糖的最新研究进展[J]. 江苏大学学报(医学版) ，2009，19(4)：366.
       
       [3]苗明三，方晓艳. 五味子多糖对正常小鼠免疫功能的影响[J]. 中国中医药科技，2003，10(2)：100.
       
       [4]门红军，刘立，谢海泉，等. 北五味子粗多糖对大鼠自由基代谢的影响[J].吉林中医药，2003，23(7)：48.
       
       [5]陈啸梅.组织化学技术[M]. 北京：人民卫生出版社，1982：227.
       
       [6]陈佛痴.组织学实验技术[M]. 北京：白医大出版社，1980：154.