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       【摘要】 
       目的研究Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA在酒精性肝病大鼠肝组织中的表达变化及五田保肝液对其表达的干预作用。方法选用健康清洁级雄性Wistar大鼠64只，随机分为对照组10只;模型组、中药治疗组、阳性对照组各18只。采用62度白酒(10 ml·kg-1·d-1)、玉米油(2 ml·kg-1·d-1)、吡唑(25 mg·kg-1·d-1)混合物灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型。12周末处死大鼠，取肝组织采用荧光实时定量RT-PCR法检测Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表达。结果模型组Bcl-2基因表达较之对照组和中药治疗组显著性降低(P<0.01)，与阳性对照组差异不明显(P>0.05);模型组Bax 、Caspase-3基因表达较之其它各组均明显升高(P<0.01);中药治疗组、阳性对照组Bcl-2、Bax 、Caspase-3基因表达与对照组相比无明显差异(P>0.05);中药治疗组和阳性对照组Bcl-2、 Bax 、Caspase-3基因表达差异亦不具有显著性(P>0.05)。结论大量饮酒可通过下调Bcl-2基因的表达，上调Bax 、Caspase-3基因的表达促进肝细胞的凋亡，导致肝损伤。而五田保肝液可通过调节Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表达，抑制肝细胞的凋亡，起到保肝护肝作用。
       【关键词】  五田保肝液;Bcl-2;Bax;Caspase-3;酒精性肝病;大鼠
       酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease，ALD)的发生与多种因素关系密切。其中，长期大量饮酒通过各种机制诱导的肝细胞凋亡是ALD发生发展的重要原因。在长期的临床实践中证明五田保肝液(专利号：ZL021581703)对ALD有预防和治疗作用，但是其具体发挥作用的靶点和机制不清。本文拟探讨五田保肝液是否对酒精性肝病大鼠肝细胞的凋亡具有干预作用。
       1材料与仪器
       1.1动物清洁级健康Wistar大鼠64只，雄性，6周龄，体质量(200±20) g，由中国医学科学院实验动物所提供。
       1.2材料和仪器
       实验用酒为62度牛栏山二锅头，由北京顺鑫农业股份有限公司生产。五田保肝液由深圳市三九现代中药有限公司提供;阳性对照药物易善复(多烯磷脂酰胆碱胶囊)生产单位为赛诺菲安万特(北京)制药有限公司，批号/BN：D8099，规格228 mg。RNA提取试剂盒RNA-Solv Reagent购自Omega公司;SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit试剂盒购自TaKaRa公司。ABI7300荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，2700型PCR System扩增仪为Applied Biosystems公司产品。
       2方法
       2.1实验分组和动物模型制备适应性喂养1周后，64只大鼠随机分为4组：对照组10只，模型组、中药治疗组、阳性对照组各18只。
       造模方法[1]：模型组、中药治疗组和阳性对照组大鼠均以62度牛栏山二锅头酒(10 ml·kg-1·d-1)、玉米油(2 ml·kg-1·d-1)、吡唑(25 mg·kg-1·d-1)混合物灌胃,2次/d,早晚各1次。中药治疗组、阳性对照组、模型组大鼠于两次灌胃之间分别给予相当于成人等剂量的五田保肝液(1 020 mg·kg-1·d-1)、易善复(123.12 mg·kg-1·d-1)和相应剂量的生理盐水灌胃，对照组则每日3次以生理盐水灌胃。各组大鼠实验期间均予全价营养颗粒饲料喂养，自由进食饮水。造模时间为12周。
       2.2荧光实时定量RT-PCR检测凋亡相关的基因表达
       2.2.1引物的设计及合成Bcl-2引物序列：forward：5′-TGAACCGGCATCTGCACAC-3′; revese：5′-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3′;Bax引物序列：forward：5′-CGGCGAATTGGAGATGAACTG-3′;revese：5′-AGCAAAGTAGAAGAGGGCAACC-3′;Caspase-3引物序列：forward：5′- CAGACAGTGGAACTGACGAT -3′;revese：5′- TTTCAGCATGGCGCAAAGTG -3′。由上海生工生物工程技术服务有限公司使用美国PE公司391型DNA自动合成仪合成引物。
       2.2.2标本的留取和处理造模12周末颈椎脱臼处死大鼠，大鼠处死前12 h禁食水。处死大鼠后迅速剖腹取出肝脏，冰生理盐水冲洗，取肝右叶部分组织置于冻存管后迅速投入液氮中冷冻保存，以备检测分子生物学指标。所有手术器械均经DEPC水浸泡和高压灭菌消毒处理。
       2.2.3总RNA的提取和检测按RNA-Solv Reagent的操作说明书提取大鼠肝组织总RNA，紫外分析及琼脂糖电泳检测总RNA的纯度、浓度及完整性。
       2.2.4逆转录反应反应条件如下:反转录反应85℃，15 min，反转录酶失活反应95℃，30 s。
       2.2.5荧光实时定量PCR检测Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达反应条件如下:第1步是预变性, 95℃, 30 s(1个循环)。第2步是PCR反应, 95℃, 5 s; 60℃, 31 s(40个循环)。反应结束后,使用7300 system SDS software软件分析PCR过程中样本的CT(Threshold cycle)值，每个标本设3个复孔，计算平均CT值，每一次反应均设定阴性对照。采用2-△△CT计算各目的基因相对反应起始拷贝数，以GAPDH为内参。
       2.3统计方法用SPSS17.0统计软件包进行统计学分析，结果以±s表示，各组数据比较采用one-way ANOVA方法检验。
       3结果
       3.1各组大鼠一般情况比较对照组大鼠健康状况良好，整个实验过程无一只死亡。模型组大鼠精神萎靡，毛发干枯蓬乱，部分大鼠出现脱毛现象，食量减少，大便稀，小便黄。至造模结束，体质量增长不明显。至12周末，因酒精误入气管死亡3只，因急慢性酒精中毒死亡7只。中药治疗组和阳性对照组大鼠情况好于模型组，精神较活跃，体质量增加较模型组快，均因酒精误入气管死亡5只，因急慢性酒精中毒死亡4只。
       3.2PCR产物鉴定各产物的熔解曲线仅有1个峰,说明为单一片段扩增,熔解温度分别为GAPDH 85.3℃,Bax 86.4℃,Bcl-2为84.6℃，Caspase-3为83.9℃。
       3.3各组大鼠肝脏组织Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表达模型组Bcl-2基因表达较之对照组和中药治疗组显著性降低(P<0.01)，与阳性对照组差异不明显(P>0.05);模型组Bax 、Caspase-3基因表达较之其它各组均明显升高(P<0.01);中药治疗组、阳性对照组Bcl-2、Bax 、Caspase-3基因表达与对照组相比无明显差异(P>0.05);中药治疗组和阳性对照组Bcl-2、 Bax 、Caspase-3基因表达差异亦不具有显著性(P>0.05)。结果见表1。表1各组大鼠肝组织Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表达情况
       4讨论
       目前，酒精滥用和依赖已成为日益严重的公共卫生问题。大量长期饮酒可导致ALD，在病理组织学上ALD可分为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化几种常见类型 [2]。近年来国内外对ALD的发病机制进行了大量研究，认为乙醇和其代谢产物的直接毒性作用以及造成机体的代谢紊乱，自身抗体形成、过氧化反应、线粒体损伤、自由基的形成和氧利用障碍等均可引起肝损伤[3]。新近研究发现，细胞凋亡在ALD的发生发展过程中发挥重要的促进作用[4]。
       凋亡是不同于坏死的一种细胞死亡形式，是细胞在生理或病理信号刺激下启动自身凋亡基因发生的主动自杀行为。凋亡目前被认为是保持组织自稳态的一个基本过程,但是过度凋亡则会引起组织损伤，进而导致功能障碍。细胞凋亡受促进凋亡因子和抑制凋亡因子的共同调节，其中发挥最主要作用的是Bcl-2家族和Caspase家族。
       Bcl-2家族和凋亡关系最密切的是Bcl-2和Bax。Bcl-2蛋白发挥抗凋亡作用，而Bax蛋白发挥促凋亡作用，二者作用的整合决定细胞的生死。单体的Bax不能诱导细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的方式一种是与Bcl-2结合成异源二聚体而抑制Bcl-2的抗凋亡作用，一种是Bax表达过量，形成同源二聚体，直接启动或诱导细胞凋亡。如果Bcl-2过量表达，则形成Bcl-2同源二聚体，抑制细胞的凋亡[5]。综上所述，细胞内两类蛋白的含量和功能状态之间的平衡是细胞调控凋亡的重要机制，当Bcl-2的含量高于Bax时，抑制了细胞的凋亡;而当Bax的含量高从而形成Bax同源二聚体时，则细胞趋于凋亡。
       本研究发现，模型组大鼠Bcl-2的表达水平比对照组显著降低，而Bax的表达水平却明显升高，这时形成Bax同源二聚体，加速肝细胞的凋亡，促进肝脏的损伤。而中药治疗组和阳性对照组的Bcl-2、Bax水平和对照组相比差别不具有显著性，提示五田保肝液主要是通过提高Bcl-2的表达，降低Bax的表达来抑制肝细胞的凋亡，起到保肝作用。
       Caspase家族成员到目前为止已区分了14种，根据它们假定的功能和同源顺序，Caspase通常被分为3组：凋亡启动因子、凋亡执行因子和炎性介导因子。凋亡执行因子包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7。尤其是Caspase-3在介导细胞凋亡的过程中发挥重要作用[6]。
       本研究另外发现，模型组大鼠Caspase-3的表达显著高于对照组，因此可得出结论Caspase-3的表达升高也是酒精造成大鼠肝细胞凋亡的另外一个分子机制。而中药治疗组和阳性对照组Caspase-3的表达与对照组无明显差别，说明五田保肝液可以通过抑制Caspase-3的上调而起到抑制肝细胞凋亡的效果。
       但是，凋亡的调节是极其复杂的。新近研究证明，Bcl-2可通过阻止Caspase-3的激活而降低细胞凋亡的发生，一旦Caspase-3被激活，Bcl-2蛋白将被Caspase-3酶解成较短的22kDa的片段，其功能发生了根本转变，抑制凋亡转换为触发凋亡[7]。由此可发现Bcl-2家族和Caspase家族在调节凋亡上的作用是密切相关的。
       长期临床应用显示了五田保肝液有良好的降酶、降脂等治疗作用，观察各类脂肪肝128例，4周后结果显示其中64例为观察组总有效率为95.31%(P<0.01)，肝功能、血脂等血生化指标明显改善(P<0.05,0.01),临床症状如肝区隐痛、乏力、腹胀等改善率好于对照组(P<0.05)。通过“清肝化湿、分化通经、解毒祛瘀”来实现保肝作用[8]。经过我们的研究结果表明，五田保肝液对酒精诱导的大鼠肝细胞凋亡的干预作用机制是复杂的，对Bcl-2家族和Caspase-3的表达均发挥了一定作用，一方面通过促进Bcl-2的表达和下调Bax的表达，提高Bcl-2/Bax的比率而发挥抗凋亡，进而保肝的功效，另一方面，Bcl-2的表达提高也阻止了Caspase-3的进一步激活，而Caspase-3的激活减少也反过来使Bcl-2的降解减少，这样一个级联反应最终使五田保肝液更有效地发挥抗肝细胞凋亡和保肝的功效。
       【参考文献】
         　[1]陈宏辉,张明亮,阳学风,等.骨调素对巨噬细胞在酒精性肝纤维化肝组织局部浸润的影响[J].肝脏, 2004, 9(4): 244.
       
       [2]吴晓枫,吕东霞.酒精性肝病的中西医治疗现状[J].中国现代医生,2008, 46 (12):41.
       
       [3]Lieber CS. Microsomalethanol-oxidizing system(MEOX):the first 30years(1968-1998)-an eview[J]. Aleohol ClinExp Res，1999，23:991.
       
       [4]Setwart S, Jones D, Day CP. Alcoholic liver disease: mechanisms and preventative Strategies[J]. Trends Mol MED,2001,7(9):408.
       
       [5]Klemm K, Eipel C, Cantré D,et al. Multiple doses of erythropoietin impair liver regeneration by increasing TNF-alpha, the Bax to Bcl-xL ratio and apoptotic cell death[J].PLoS One,2008;3(12):e3924.
       
       [6]Watanabe M, Kitano T, Kondo T, et al. Increase of nuclear ceramide through caspase-3-dependent regulation of the“sphingomyelin cycle”in Fas-induced apoptosis[J]. Cancer Res,2004,64(3): 1000.
       
       [7]Fu, Y.-F., Fan, T.-J. Bcl-2 family proteins and apoptosis[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2002, 34 (4): 389.
       
       [8]毕业东. 五田保肝液治疗脂肪肝128例[J].陕西中医,2007,28(9):1125.