【摘要】 蛤蚧作为重要的动物药材，在咳嗽、哮喘、胆结石及性功能障碍上有治疗功效。由于药材蛤蚧原动物大壁虎(Gekko gecko)物种数量逐年减少，不能满足中药市场的需求而出现了众多伪品。文章概述了近二十年来蛤蚧及其伪品的鉴别研究情况，介绍了传统性状、显微、理化和现代分子生物学技术等鉴定方法，并比较总结了各种方法在蛤蚧真伪品鉴定中的特点。在此基础上，引入物种识别学科前沿-DNA条形码(DNA Barcoding)技术，并阐述了其在蛤蚧真伪品鉴定中的优势和应用前景。
【关键词】 蛤蚧;DNA条形码;中药鉴定
蛤蚧，传统名贵滋补中药材，来源于壁虎科动物大壁虎Gekko gecko (Linnaeus)(隶爬行纲Reptilia，有鳞目Squamata，壁虎科Gekkonidae，壁虎属Gekko)除去内脏的干燥体，其性平、味咸，归肺、肾经，具有补肺益肾、纳气定喘、助阳益精之功效，多用于治疗肺虚气喘、劳嗽咳血、阳痿遗精等症[1]。
蛤蚧作为中药材使用具有悠久的历史，市场需求量大。然而，由于自然环境的变化和人为因素干扰，蛤蚧野生资源正遭到严重破坏，产量急剧下降，导致出现“越捕越贵，越贵越捕”的怪圈[2]。同时，由于蛤蚧药材价格昂贵，为谋求暴利，一些药贩常以假充真，导致市场上蛤蚧伪品增多。据不完全统计多达数十种，常见伪品有小蛤蚧(壁虎 Gekko chinensis，无蹼壁虎 G.swinhonis，中国瘰螈 Paramesotriton chinensis)、蛤蚧蛙(多疣壁虎 G . japonicus)、细蛤蚧(荔波壁虎 G .liboensis)、土蛤蚧(睑虎 Goniurosaurus lichtenfelderi、 西藏沙蜥 Phrynocephalus theobaldi、 红瘰疣螈Tylototriton verrucosus、贵州疣螈T. kweichowensis)、海蛤蚧(红瘰疣螈T.verrucosus)、西藏蛤蚧(喜山鬣蜥Laudakia himalayana)、马鬃蛇(变色树蜥 Calotes versicolor)、红点蛤蚧(蜡皮蜥 Leiolepis reevesii)、沙蜥(青海沙蜥 P.vlangalii)、石龙子(中国石龙子Eumeces chinensis)、羌活鱼(山溪鲵 Batrachuperus pinchonii)、四脚鱼(东方蝾螈 Cynops orientalis)等[3]。如此种类繁杂的伪品的出现，使得本已缺乏监管的中药材市场更加混乱，导致中药材蛤蚧的质量难以保证，严重影响其临床使用的安全。故此，对蛤蚧真伪品的鉴别问题已日趋严峻，建立一套准确、高效且切实可行的鉴别方法对蛤蚧中药材市场的监管较之以往的任一时期更为迫切。到目前为止，针对蛤蚧及其伪品的鉴别方法众多，主要有性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别和分子生物学鉴别等。本文对这些方法进行了汇总，并就其各自的优点及不足进行了归纳。针对这些方法所存在的局限性，引入近年迅速崛起的学科前沿——DNA条形码(DNA Barcoding)技术，并就其在蛤蚧鉴定中的优势及可行性进行介绍。
1蛤蚧真伪品鉴定方法回顾 1.1性状鉴别性状鉴别指人们依据各种药材的性状差异，对药材的形、色、味、大小等特征进行观察，区分药材真、伪、优、劣的方法。该鉴定方法需要完整的蛤蚧，根据蛤蚧的长度、鳞片、眼睑、头部、背腹部、指趾、尾部等差异进行鉴别。如：朱华等[3]对蛤蚧商品市场进行了调查，并收集了各类商品蛤蚧共18种，选择样品长度、头部、吻鳞、眼睑、鳞片、背腹部、指趾、尾及其他特征、地理分布等特征进行原动物鉴定，并根据这些性状编定了鉴定18种蛤蚧及其混伪品的检索表，借此将蛤蚧及其伪品相区分。同类报道还有许多[4~6]。性状鉴别是传统中药鉴定的主要方法，由于其直观简便，在蛤蚧的鉴定中仍在使用。但是，性状鉴别有很强的专家经验依赖性，并且对多来源药材、破碎药材、粉末药材以及中成药的鉴定有一定的局限性[7]。大多数的伪品就是利用其与真品的相似性而蒙混进入中药市场，且出现了一些药材移花接木的现象[8]，使得该方法面临更多因难。
1.2显微鉴别显微鉴别是利用显微镜观察药材的组织切片、粉末、解离组织或表面制片及成方制剂中药材的组织构造、细胞形状或内含物等特征的一种方法。在蛤蚧显微鉴定中，该方法主要是观察其鳞片、皮肤碎片、骨碎片等差异进行鉴定。例如：朱华等[9]对中药商品蛤蚧及海蛤蚧(红瘰疣螈)进行了鳞片显微观察，并对其特征进行了描述;侯丽光[10]对正品蛤蚧粉末的鳞片、皮肤碎片、骨碎片和横纹肌纤维的特征进行显微观察并描述，为蛤蚧真伪品鉴别提供了旁证资料。显微鉴别方法适用于破碎状、粉末状及丸、膏、丹等中成药样品，在一定程度上弥补了性状鉴别的不足。但是中药蛤蚧常以干燥全体入药，使得显微鉴定在蛤蚧真伪鉴别中应用范围较小。同时显微鉴定也具有一定的经验和理论水平的局限，并且蛤蚧的显微鉴定方法尚未形成既定的标准，因此应用此方法来鉴定蛤蚧仍有困难。
1.3理化鉴别 所谓理化鉴别是通过物理、化学方法或仪器分析药材中存在的某些化学成分及性质，以此来鉴定药材的真伪和质量。特别值得一提的是近年呼声较高的指纹图谱分析，即通过一定的分析手段，得到能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。该类方法在蛤蚧及其伪品的鉴别中也有较多运用，如廖汉成等[11]采用薄层色谱法对经超微粉碎后的蛤蚧超微饮片样品与蛤蚧药材进行薄层层析对比;朱华等[9]对商品蛤蚧(广西蛤蚧和泰国蛤蚧)及其混伪品海蛤蚧(红瘰疣螈)进行了紫外光谱和高效液相色谱等方法鉴别;王丽娟等[12]对蛤蚧及其伪品微量元素进行了测定，建立了微量元素特征谱带;朱志峰等[13]采用粉末X衍射Fourier谱分析等等。理化鉴定，尤其是指纹图谱分析方法在中药的质量控制和鉴定的规范化迈出了重要的一步，但由于其主要对次生代谢物的分析，容易受生长周期和取材部位等因素的影响，其化学成分呈现多变性;并且中药复杂的化学成分也使得化学鉴定方法应用遇到一定的困难[14，15]。指纹图谱对有效成分的分析更适合于蛤蚧质量控制，而用于真伪中药的鉴别其准确性和实用性均存在障碍，与之相关的规范化鉴定标准极难制定。
1.4分子生物学技术鉴定现代分子生物学主要是对生命的遗传物质DNA及其表达产物蛋白质进行微观研究，因此涌现了多种以检测蛋白质和DNA分子标记的鉴定技术。
1.4.1蛋白质理化性质鉴别
蛋白质作为动物体内行使生物功能的重要物质，不同种的动物其蛋白的表达和结构有特异性，因此可利用其蛋白质特有的理化性质，如：等电点和对流动的阻抗能力(即粘度)的差异对蛤蚧及其伪品进行比较。刘训红等[16，17]利用改进的蛋白质等电点法和测定蛋白粘度的方法对蛤蚧及其伪品进行测定，结果表明蛤蚧与其伪品之间等电点和蛋白粘度存在差异，可作为破碎状及中成药中的蛤蚧真伪鉴别的方法参考。蛋白质的理化鉴别受很大的遗传表现型的影响，并且用于真伪鉴别的信息量少，当出现大量不同种伪品进行鉴别时，会出现相同的数据结果而失去判断标准。
1.4.2蛋白质电泳鉴别
根据不同物种蛋白质分子大小和所带净电荷密度等差异所引起的迁移率不同来反映蛤蚧及其伪品的差异。鞠爱华等[18]和芮代莉等[19]分别利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和乙酸纤维素薄膜电泳对蛤蚧及其常见伪品进行可溶性蛋白电泳检测，表明蛤蚧与其他伪品的可溶性蛋白电泳谱带的分布、条数、宽度和迁移位置上有差异。分析同工酶酶谱的变化也可作为鉴定物种的参考之一。 秦新民等[20]采用垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，比较了蛤蚧不同地理种群的乳酸脱氢酶、酯酶和乙醇酸脱氢酶同工酶，结果表明，广西种群(黑蛤蚧)与越南种群不仅形态相似性高, 而且也具有较多的共同酶带, 而泰国种群(红蛤蚧)的乳酸脱氢酶和酯酶酶带与广西和越南种群之间差异较大。直接对样品总蛋白质提取进行电泳的方式面临蛋白成分不明确，实验的重复性难以保证的缺陷。同工酶作为一种精细的研究方法，适合于亲缘关系较近的分类与进化、遗传与变异等基础理论研究，在中药鉴定中由于其繁琐的实验操作而很少被采用。
1.4.3DNA分子标记
DNA分子作为遗传信息的直接载体，信息含量大，在同种或同品种内具有高度的遗传稳定性，且不受外界环境因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，因此用DNA分子特征作为遗传标记进行中药鉴别更为准确可靠[21]。归纳起来主要有几类：①基于限制性片段长度多态性(RFLP)方法的鉴定;②基于PCR方法的鉴定;③基于DNA序列分析的鉴定。基于RFLP类方法存在实验技术繁琐，DNA模板质量要求高、用量大，要求新鲜的材料等不足;基于PCR方法的RAPD或AP-PCR在实际应用中，存在实验重复性差等问题而受到很多质疑。这两类方法在蛤蚧鉴定中运用极少，仅见于秦新民等[22]关于遗传多样性方面的理论研究。DNA序列分析是通过测定目的基因片段的核苷酸序列，并比较序列间的差异来确定各类群间有鉴别意义的特异性位点，从而达到鉴定的目的[23]。DNA测序技术的发展，克服了传统分子克隆测序烦琐的试验步骤，提高了该方法的效率，同时由于成本的降低使该方法有较好的发展应用前景。目前，基于DNA序列分析的方法在蛤蚧鉴定中大多进展到基础理论研究水平。如，张月云等[24]和韩德民等[25]从系统发育的角度，测定了蛤蚧及壁虎科相关物种的12S rRNA序列，结果表明蛤蚧与同属类其他物种(多疣壁虎、无蹼壁虎和铅山壁虎)序列差异明显。秦新民等[26]和韦素玲等[27]测定了蛤蚧及壁虎科相近物种的细胞色素b基因序列，显示蛤蚧序列与其他物种有显著差异，并且红黑蛤蚧之间序列也有部分差异，但小于种间差异。仅Liu等[28]分别以来自壁虎科、蝾螈科、鬣蜥科和小鲵科共17个样本的线粒体12SrRNA基因序列为基础，设计了一对针对蛤蚧等位基因特异扩增引物，可将蛤蚧与其伪品相区分，该研究具有较明显的应用前景。
1.5蛤蚧鉴定回顾综上所述，在蛤蚧原动物及其伪品的鉴别方法中，性状鉴定仍是蛤蚧真伪品鉴定的主要方法，但因专家经验依赖和形态数据的观察的主观性，其准确性存在一定的局限;显微鉴定是性状鉴定的辅助手段;理化鉴定主要适用于质量控制，且难于形成标准。DNA表达产物蛋白质、同工酶等的分子技术提供了另一层次的方法，但在鉴定中重复性较差，操作较复杂，在实际鉴定中难于实现。DNA分子标记具信息量大、稳定性强等优势，其中基于DNA序列的分析方法因更为准确、简便、迅速从而崛起成为当今主流。表1中列出了对中药蛤蚧鉴定方法的比较，从表中可以看出各种方法的优劣。表1鉴定方法比较
2DNA条形码在蛤蚧鉴定中的应用前景 DNA序列分析在众多的鉴定方法中显现出一定的优势，而以线粒体细胞色素C氧化酶亚单位I(COI)基因序列为基础的DNA条形码技术在物种鉴定方面的优势已在学术界备受关注。
2.1DNA条形码及其研究现状
2.1.1 DNA条形码概念DNA条形码识别为加拿大Hebert教授于2003年率先提出的有关生物物种识别的最新概念[29~31]，即利用一段标准DNA序列片段为基础从而实现快速、准确和自动化的物种鉴定。在大多数的动物类群中，现系指长度为648 bp的COI基因序列片断。运用它来进行物种鉴定，是利用其序列信息为基础，借助于一定的技术与方法来进行物种识别。DNA条形码是近年来进展最迅速的学科前沿之一。DNA 条形码的主要创新之处在于利用目前DNA 分子标记技术稳定性强和DNA序列分析信息量大的特点对所有物种进行统一研究，样本鉴定过程能够实现自动化和标准化，突破了对经验的过度依赖。DNA条形码运作优势在于其全球共享的DNA条形码序列平台，通过数据库信息共享可实现更大规模物种的鉴定以及良好的信息和数据交流。
2.1.2DNA条形码编码原理
DNA条形码的理念来源于现代商品零售业条形编码系统(UPC)。它利用DNA序列信息量大的优势，即每个碱基位点有A、T、G、C 四种可能的情况, 以一种四进制的方式进行排列组合，只需要15 个碱基位点就能出现415( 大于10亿) 种编码方式, 这个数字是现存物种的100 倍。换言之，按理论计算，只需要15 个碱基位点排列组合的DNA序列数量即可满足现有物种间的区分。但考虑到相近物种序列同源性和在蛋白编码基因中密码子的简并性，结合当前单次测序约800 bp的特点，从而选用几百个碱基的基因序列信息作为物种鉴定的基础简便易行。
经大量的统计分析后，COI序列5’端的648 bp的碱基序列的位点信息能有效反应物种间差异。线粒体DNA(mtDNA)由于其母系遗传、无内含子、无等位基因重组、高拷贝数等特点，以及大量的分子进化研究数据表明线粒体基因组是DNA条形码序列的首选[32]。Hebert等在分析13,320种分布于11个动物门类的物种的COI序列后，发现98%的物种种内遗传距离差异在0～2%之间，种间平均可达到11.3%，非常符合物种水平鉴定的要求。对某些物种来说, COI序列还具有足够的结构特征可将其定位到特定的地理种群[33]。
2.1.3DNA条形码发展DNA条形码一经提出，就除具有常见DNA分子标记技术的优势外，并且以其标准统一和自动化的方式受到众多物种鉴定和分类学家的追捧。2003-03，在美国著名的冷泉港 (Cold Spring Harbor) 实验室主持下，来自美、加、英、德、挪威、丹麦等国家的三十多位科学家汇集在一起，通过了收集地球上所有物种的同一基因片段, 建立物种DNA条码数据库的决议，以解决物种鉴别问题。随后已开展的多项DNA条形码计划，包括：鸟类(ABBI)、鱼类(FISH-BOL)、海洋生物(MarBOL)、实蝇(TBI)、蚊子(MBI)、蜜蜂(Bee-BOL)等。并且生命DNA条形码协会(CBOL)已建立三个与大众沟通并为大众服务的公众网络平台：①Canadian Centre for DNA Barcoding(
http://www.dnabarcoding.ca/);②Canadian Barcode of Life Network (
http://www.bolnet.ca/);③Barcode of Life Data System (
http://www.barcodinglife.org/views/login.php)。
2.2蛤蚧DNA条形码鉴定
2.2.1DNA条形码在蛤蚧鉴定中的优势
标准、快速、稳定是中药鉴定未来发展的必然趋势，而将DNA条形码识别技术用于中药鉴定正是契合了这一要求。陈士林等[34]对DNA条形码技术的引入中药材鉴定进行了介绍，对DNA条形码的特点，在中药鉴定中的应用及前景和存在的问题进行了陈述。DNA条形码技术相比较于现有的鉴定方法具明显优势(见表1)。
对比上述主要鉴定方法，DNA条形码识别技术的优势主要体现在：①准确：特定的物种具有特定的DNA短片段序列信息，而形态鉴别特征常有的趋同和变异会导致真伪品鉴定误差。②非专家鉴定：由于DNA技术是可机械重复的，可设计一套简单实验技术，经过简单培训的技术员则可操作。这样的工作可投放到基层单位，以解决缺乏专业技师带来的尴尬。③所检对象无组织材料特异性：同一个体的不同组织材料来源的DNA序列信息是一致的。实际工作中，所需检定的中药产品形式往往多种多样，化学成分含量也大相径庭。④所检对象无生活周期的特异性：同种生物的DNA序列信息在不同的生命周期是相同的，所以该技术检测对象可以是生物生命过程中的每一时期，较之传统的方法常需要成体为对象而扩大了检测范围。⑤大量、迅速：可通过建立DNA条码数据库，利用网络传输、试剂盒、基层单位简单的实验室等，一次快速鉴定大量样本。⑥基于标准DNA序列片段为基础，鉴定过程能够实现自动化和标准化。
现有的DNA条形码项目主要针对动物类群，在鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类均已开展，因此将DNA条形码技术用于蛤蚧真伪品的鉴定中的方法和技术已日趋成熟。蛤蚧及其伪品均属于爬行或两栖动物，COI序列在这些类群中已能有效的区分物种，不需再研究探索基因组中更适合DNA条形码的DNA序列;其通用引物序列可参考在脊椎动物中已有的相关研究[35，36]。
DNA条形码技术最初是通过比较动物线粒体COI序列的遗传距离而提出，用COI序列在动物类中药材的鉴定相比植物类中药材鉴定序列有明显优势。植物中DNA条形码的研究进展相对缓慢，目前尚处于对所提议的各片段比较和评价阶段，还未获得一致的标准片段。由于植物线粒体DNA碱基置换速率低，因此线粒体COI基因不能作为植物DNA条形码技术的候选基因。提议的编码基因片段主要有rpoB，rpoCl，matK，rbcL，UPA，非编码区片段有trnH-psbA，atpF-atpH，psbK-psbl，此外还有核基因ITS，已有的研究表明以上任何一个单片段都还不足以区分所有植物物种，因此植物类中药材的DNA条形码鉴定尚需探讨[37，38]。
2.2.2DNA条形码在蛤蚧鉴定中的应用前景
2.2.2.1蛤蚧真伪品鉴定DNA条形码数据库为了蛤蚧真伪品鉴定的规范和标准化，可专门建立蛤蚧真伪品DNA条形码数据库。DNA条形码数据库中可收录蛤蚧及相关伪品的形态特征，生物学特性，药效和DNA条形码序列等信息，并建立联网检索查询、序列比对系统。通过数据库的构建，可将待检样品条形码序列信息与数据库中已知信息进行比对分析，从而达到真伪品识别的目的。同时，借助于该数据库可以迅速的查阅检测样品的相关信息。针对蛤蚧真伪品专有DNA条形码数据库的建立可使这些查询、比对、甄别等过程更加简便、快捷。
2.2.2.2基于DNA条形码序列的鉴别方法展望
DNA 条形码识别技术的核心部分是找到能区分各物种序列片段，以及为所有物种的这段序列进行编码。含有所有物种编码序列的资料源在物种鉴定中是重要的数据信息，因此可基于DNA条形码序列本身，而设计出一些更简捷的鉴定方法。 针对蛤蚧及其伪品DNA条形码序列设计特异性扩增引物，通过PCR特异扩增的方法达到鉴别的目的。这种DNA分子标记中特异引物鉴别的方式，以其利用了在物种鉴定上更具意义的COI序列设计的引物，比使用其他序列片段来设计引物的实用性和可推广性更高。随着DNA条形码识别技术逐步深入，可将其与基因芯片技术相结合达到更快速，高通量的鉴定要求[39，40]。DNA条形码与基因芯片技术相结合可形成一种新的分子鉴定方法——DNA条形码芯片(DNA barcoding chips)。DNA条形码芯片是在DNA条形码序列分析基础上，针对其变异位点，分别设计特异性探针，探针经固化于DNA芯片片基上制作成芯片。通过样品PCR产物与芯片探针特异性杂交和荧光杂交检测分析，达到鉴定的目的。DNA条形码芯片技术可为中药材鉴定提供快速、高通量的检测工具。中药材蛤蚧鉴定的目的是应用快速、低成本、灵敏准确的成套规范化检测技术来确保药材的监管及市场的稳定，而DNA条形码识别技术正是在这种应用的需求下应运而生。DNA条形码识别技术为中药材真伪鉴定标准化、自动化提供了技术支持，将为中药鉴定市场迎来一场新的技术革新。
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