文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【关键词】  护理；,,酒精性肝损伤；,,营养素；,,大鼠
       摘要：目的观察“护肝灵”对酒精性肝损伤的影响。方法给大鼠连续口服乙醇42 d，取其股动脉血离心后测肝功能，取肝脏匀浆的测考乌斯亮兰蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶、维生素E。结果“护肝灵”低、中剂组均可提升考乌斯亮兰蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶、维生素E的含量。结论 “护肝灵”缓解酒精性肝损伤过程中营养素的消耗。
       关键词：护理；  酒精性肝损伤；  营养素；  大鼠
       乙醇只提供热量，不提供营养素，因此长期大量饮酒可导致营养素缺乏，而营养养素缺乏又成为酒精性肝损伤的致病因素。我们通过乙醇灌胃法复制酒精性肝损伤模型，来观察“护肝灵”抗酒精性肝损伤与营养素数量变化之间的关系。现报道如下。
       　　1   材料
       1.1  动物  同批繁殖Wistar大鼠50只，全♂，体质量180～220 g, 四川大学华西动物中心提供，合格证书号：医动字2401011号。
       1.2   95%乙醇（ethanol，EtOH）（分析醇） 成都蜀都实业有限责任公司生产，批号：200251。
       1.3  “护肝灵”胶囊  0.3 g/粒，相当于生药2.14 g/粒，四川天然药物研究所加工。
       1.4   多烯磷脂酰胆碱（Polyenephosphatidylcholie,APSULES、商品名：易善复） 生产厂：A.Nattermann&Cie.Gmbh Koln，批号：H20020026。
       1.5   肝匀浆介质pH 7.4，0.01 mol/L缓血酸氨（TrisHCl），0.0001 mol/L 乙二胺四乙酸钠（EDTA2Na），0.01 mol/L蔗糖,0.8%的氯化钠（NaCl）溶液,所用试剂在成都试剂厂购置。
       1.6  考马斯亮兰蛋白（CBBG250蛋白）试剂盒 南京建成生物工程研究所生产，批号：20030916。
       1.7  谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)试剂盒 南京建成生物工程研究所生产，批号：20030917 。
       1.8    维生素E（Vitamin E ,VE）试剂盒 南京建成生物工程研究所生产，批号： 20030918。
       　　2  方法
       2.1   动物分组造模及给药 常规饲养7 d后，称量体质量，按体质量大小分4层后随机分为正常对照组（简称正常组）、模型对照组（简称模型组）、“护肝灵”低剂量预防给药组（简称低剂量组）、“护肝灵”高剂量预防给药组（简称高剂量组）、易善复预防给药对照组（简称对照组），每组10只；除正常组外，其余各组用50%乙醇按12 ml/Kg造模；低剂量组、高剂量组同时分别予“护肝灵”(0.15 g・Kg1・d1)、(0.3 g・Kg1・d1)剂量的稀释液灌胃（予蒸馏水稀释，依次相当于人每次用量的5倍、10倍，人每日用量的2.5倍、5倍）；对照组予易善复（0.15 g・Kg1・d1）稀释液灌胃（予蒸馏水稀释）；造模与给药均连续42 d。
       2.2   观察 造模及给药期间，各组均普食普水饲养，连续观察大鼠的活泼及自卫、饮食饮水、体毛皮表、死亡及其它（大小便、分泌物）等情况，并记录。
       2.3   标本采集和制作 造模及药物干预结束后，禁食禁水12 h，称量体质量，取大鼠股动脉血2 ml，-196℃液氮保存携带，45℃温箱孵育、3 000 r/min离心，取上清液检测：甘油三酯（TG），白蛋白（ALB），球蛋白（GLOB），并计算A/G；剖开大鼠胸、腹腔，取肝、心、脾、肺、肾、睾丸等观察色泽改变情况，并用电子天平称量各脏器质量，计算脏器系数；取大鼠肝脏胸侧叶下第二层的三叶中的右侧叶肝脏作标本, -196℃液氮保存携带、-60℃保存,肝标本用0.86%冷生理盐水洗涤，滤纸吸干水份，准确称重，移取9倍肝重冷匀浆介质的1/3到匀浆玻璃管中，剪碎，约12 000 r/min冰水中间隙匀浆4次，吸出到离心管，其余冷匀浆介质2/3洗涤匀浆玻璃管，移到前述离心管，3 000 r/min离心15 min，取上清液，制成10%的肝匀浆储备液，按试剂盒说明书检查CBBG250蛋白、GSHPx、VE。
       2.4   统计学方法使用PEMS3.1统计软件处理数据，所有计量资料用(±s)表示，组间比较用 t检验(方差齐时)或秩和检验(方差不齐时)。P＜0.05为有统计学意义。
       　　3  结果
       3.1   活泼及自卫、体毛光顺、饮水饲食、死亡等情况 在整个实验过程中，正常组大鼠活泼、自卫意识强烈、体毛光顺、饮水饲食正常、无死亡。其余各组大鼠活泼、自卫意识均有降低，尤其以模型组为甚，交替出现烦躁、嗜睡、明显疲软状态；体毛光顺程度下降，表现为毛逆、成团、欠光泽；饮水饲食能力略有下降；在整个实验过程中，高剂量第3只大鼠死亡、对照组第4只大鼠死亡，死亡原因为咬打，大体解剖无异常发现。
       3.2   大鼠体质量、内脏质量及脏器系数等情况 体质量、内脏质量、睾丸质量等结果见表1。各组间体质量、心脏质量、肺脏质量、肾脏质量、睾丸质量等相互比较，差异均无显著性（P＞0.05）；模型组大鼠肝脏质量、脾脏质量均较正常组明显升高（P＜0.05）；“护肝灵”高剂量和低剂量的大鼠肝脏质量、脾脏质量均低于模型组，差异有显著性（P＜0.05）。
       3.3   大鼠血中TG，ALB，GLOB及A/G测定结果 见表3。各组间TG，ALB，GLOB及A/G相互比较，差异均无显著性（P＞0.05）。
       3.4   大鼠肝组织匀浆检测CBBG250蛋白，GSHPx，VE含量 结果见表4。模型组大鼠肝匀浆中CBBG250蛋白，GSHPx，VE的含量较正常组明显降低，差异有显著性（P＜0.05）；“护肝灵”高剂量组和低剂量组肝组织匀浆中CBBG250蛋白，GSHPx含量均较模型组明显升高，差异有显著性（P＜0.05）；“护肝灵”低剂量组肝组织匀浆中V-E的含量较模型组明显升高，差异有显著性（P＜0.05），“护肝灵”高剂量组肝组织匀浆中V-E的含量较模型组有升高趋势，差异无显著性（P＞0.05）。
       表1  大鼠体质量、内脏质量、睾丸质量等结果（略）
       与正常组比较 *P＜0.05; 与模型组比较 #P＜0.05脏器系数（脏器质量/体质量×100%）结果见表2 。各组间心脏、肺脏、肾脏、睾丸等的脏器系数相互比较，差异均无显著性（P＞0.05）；模型组大鼠肝脏、脾脏的脏器系数均较正常组明显升高（P＜0.05）；“护肝灵”高剂量和低剂量的大鼠脾脏的脏器系数均低于模型组，差异有显著性（P＜0.05）。
       表2  大鼠脏器系数结果（略）
       与正常组比较 *P＜0.05；与模型组比较 # *P＜0.05；与低剂量比较 Δ*P＜0.05
 
　　肉眼可见正常组大鼠肝脏颜色鲜红，被膜光滑，胆囊、胰脏、肺脏、心脏、脾脏、睾丸均正常，腹下脂肪较少。模型组大鼠肝脏颜色紫暗，质稍软，无光泽，有的与邻近器官轻度粘连，肉眼可见肝脏出现肿大现象，肺脏出现萎缩现象，腹壁下脂肪层肥厚堆积。各给药组大鼠肝脏颜色介于正常组与模型组之间呈暗红色，内脏大小适度，未观察到异常现象，肉眼可见给药各组大鼠体内腹壁下脂肪少于模型组大鼠。
       表3  大鼠 TP、ALB、GLOB及A/G结果（略）
       组间比较差异无显著性 P＞0.05
       表4  大鼠肝组织匀浆中CBBG250蛋白、GSHPx、VE含量（略）
       与正常组比较*P＜0.05；与模型组比较 #P＜0.05；与低剂量组比较 ΔP＜0.05
       　　4  讨论
       对于酒毒，中医认为“戒酒”是根本的治疗方法，而不饮酒则是最佳预防措施，但正如《灵枢・师传第二十九》中说：“血食之君，骄恣从欲轻人，而无能禁之。禁之则逆其志，顺之则加其病，便之奈何？治之何先？”执行情况常不如人意。《素问・藏气法时论篇第二十九》认为：“肝苦急，急食甘以缓之，……肝欲散，急食辛以散之，用辛散之、酸泻之”。金元・李杲《脾胃论》立“饮酒过伤”专篇，提出“只当发汗，汗出则愈矣，其次莫如利小便。二者乃上下分消其湿”［1］ 。酒之为病属湿热为患，清热祛湿为具体防治方法。清热以性寒之品，祛湿用味苦之品可燥湿、芳香之品可化湿、健脾之品可运湿。所以，“护肝灵”以“未病先防”为大法，取“以疏代堵”为小法：清热、祛湿、运脾、发汗、利小便等为具体方法。在博士后导师张立实教授指导下，作为潘年松博士在博士后流动站期间的自由研究课题，共同精选枳、虎杖、砂仁、白茅根等中药组方，其具体组方及工艺已由四川大学科技处申请专利保护，专利申请号为20041004864.2。
       4.1   CBBG250蛋白 蛋白质分子具有NH3基团，当棕红色的CBBG250显色剂加入蛋白标准液或样品中时，CBBG250染料上的阴离子与蛋白NH3结合，使溶液变为蓝色，通过测吸光度可计算出蛋白含量。如此测得的是肝组织匀浆中的总蛋白。
       4.2  GSHPx  是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。它特异的催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。GSHPx的活性中心是硒半胱氨酸，硒是GSHPx的必须部分，每克分子酶含4 g原子硒。测定GSHPx的活力可以作为衡量机体硒水平的一项生化指标。
       4.3  VE  VE在菲罗啉的存在下，可使三价铁离子还原成二价铁离子，后者在特定的环境下可与菲罗啉形成红色复合物，通过比色，在标准曲线上可查出VE的含量，或者通过公式计算出V-E的含量。
       4.4   乙醇与营养素 乙醇只提供能量，不提供营养素。所以，长期饮酒会影响营养素的供给继而引起营养素不良。营养素不良在酒精性肝病（ALD） 的发生机制中的常见原因有：饮食脂肪的影响，应用植物油与酒精同时投予的试验表明, 高脂肪比低脂肪易于引起ALD而且程度较重；微量元素的影响，过多的铁因可增强脂质过氧化而为ALD之促进因子, 锌则因有膜稳定和抗氧化作用而可减轻ALD；其它如VE、谷胱甘肽（GSH） 等抗过氧化物质之不足则为ALD之促进因素［2］。肝细胞合成白蛋白的能力强而迅速，正常人每天能合成10 g 左右的蛋白质,当肝功能严重受损时,血浆胶体渗透压可因ALB的合成不足而降低，同时GLOB浓度反而增高，导致血浆A/ G 降低。肝功能受损时，会降低肝细胞制造ALB的能力,使血清中A/ G的比例降低［3］。同时，酒精引起肝细胞受损时,乙醇代谢产生的乙醛影响蛋白质转运和分泌［4］。每日饮酒大于100 g且蛋白摄入少者易发生脂肪肝［5］。肝脏低温保存再灌注过程中，肝细胞内高糖原含量能显著拮抗再灌注期间肝实质细胞凋亡的发生；其可能与高糖原含量的肝实质细胞内三磷酸腺苷充裕，细胞膜上钙离子三磷酸腺苷酶功能完善，细胞内外钙离子平衡相对稳定有关［6］。肝脏缺血初期肝细胞内的无氧糖酵解无疑是其赖以生存的能量来源,但随着缺血时间的延续,胞浆内贮存的能量代谢底物不断耗竭,细胞无氧糖酵解功能也逐渐减退,最终将导致细胞内生物能量缺乏并引发一系列病理改变。因此,若能增加肝细胞能量代谢底物的负荷,则有望延长肝脏耐缺血时间,从而减轻肝脏缺血再灌注损伤程度［7］。
       　　5  结论
       本研究的结果显示：各组间大鼠血中ALB、GLOB、A/G均无明显改变（P＞0.05）。模型组大鼠肉眼观察下肝脏颜色较正常组暗，肝脏质量、脾脏质量及肝脏系数、脾脏系数均较正常组明显升高（P＜0.05），肝匀浆中CBBG250蛋白、GSHPx、VE的含量较正常组明显降低（P＜0.05）。“护肝灵”高剂量组和低剂量组均可改善肉眼观察下肝脏颜色改变；均可明显降低大鼠肝脏质量、脾脏质量和脾脏系数（P＜0.05）；均可明显升高肝组织匀浆中CBBG250蛋白、GSHPx含量（p＜0.05），其中CBBG250蛋白含量均接近正常组（p＞0.05）；“护肝灵”低剂量组可明显升高肝组织匀浆中V-E的含量（P＜0.05），“护肝灵”高剂量组有升高趋势（P＞0.05）。另外，各组大鼠血中ALB、GLOB、A/G均无明显改变（P＞0.05），而模型组大鼠肝组织匀浆中CBBG250蛋白却较正常组明显减少（P＜0.05），说明血中的ALB、GLOB、A/G在反映肝组织中蛋白质含量方面，不如肝组织匀浆中CBBG250蛋白敏感。
       　　参考文献：
       ［1］  湖南省中药研究所.《脾胃论》注释［M］.北京：人民卫生出版社,1976：402.
       ［2］  森本道雄.酒精性肝损伤的最新研究进展［J］.日本医学介绍,1997，18(10)：447.
       ［3］  向  敏,王光莲,丁龙其.复方玄驹胶囊对实验性肝损伤小鼠的保护作用［J］.中国现代医学杂志,2002,12(24):60.
       ［4］  Knittel T,Dinter C,Kobold D,Neubauer K,Mehde M,Eichhorst S,Ramadori G.Expression and regulation of cell adhesion molevules by hepatic atellate cells ( HSC) of rat liver : involvment of HSC in recruitment of onflammatory cells during hepatic tissue repair［J］. Am J PATHOL ,1999,154:153.
       ［5］  田翠时,宋广杰,侯丽娟,等.护肝饮对大鼠酒精性肝损伤的保护作用研究［J］.中医药学刊,2004,22(1):181.
       ［6］  汤礼军,田伏洲,王  雨,等.低温保存再灌注肝脏糖原含量与肝细胞凋亡的关系［J］.中华实验外科杂志,2002,19(2):154.
       ［7］  汤礼军,田伏洲,王  雨, 等.肝细胞糖原拮抗肝脏缺血再灌注损伤及其相关机理的研究［J］.中国普外基础与临床杂志,1999，6(4)：196.

　　(遵义医药高等专科学校，贵州 遵义  563000；  四川大学分析测试中心，四川 成都  610000四川大学华西公共卫生学院，四川 成都  610000)