【摘要】 目的灯盏花作为一种重要的中草药，野生资源已不能满足市场需求，因而从相似物种中寻找替代资源是一种重要的途径。方法通过灯盏花与部分菊科植物的ITS序列构建系统树以及和其它物种的ITS序列构建系统树来分析ITS构建的属间系统树、目间系统树与传统系统树相比的同源性差异，以探究灯盏花的遗传背景，进而进行相关实验和研究。结果ITS在属内系统发生上表现出可靠性。结论利用ITS寻找近源替代物种是可行的。
【关键词】 灯盏花;ITS;系统发生;同源性
Abstract：ObjectiveErigeron breviscapus(Vant.) Hand-Mazz.is a kind of important Chinese herbal medicine,its natural resource can’t meet the demand of market,so find a substitute from similar speices is an important way to resolve this problem. MethodsUsing the ITS sequence of Erigeron breviscapus(Vant.) Hand-Mazz,some species of feverfew ,and other species to construct phylogenetic tree,then to find the difference of homology between the ITS phylogenetic tree of different genus or orders and traditional Phylogenesis,in order to quest the genetic background of Erigeron breviscapus(Vant.) Hand-Mazz,and carry out some relative experiments or research.ResultsThe phylogenesis in a genus based on ITS was reliable.ConclusionUsing ITS to find a similar substitutable species is practical.
Key words：Erigeron breviscapus(Vant.) Hand-Mazz;ITS;Phylogenesis;Homology
灯盏花学名短葶飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz，为菊科(Composttiae) 紫苑族(Trib.Astereae Cass.)飞蓬属(Ergeiorn)的多年生草本植物，主产于我国云南，以及湖南、广东、广西、贵州、四川等省，其中95%以上的野生资源分布于云南[1]。作为民间草药，其在云南部分少数民族地区的运用已有六百多年历史[1，2]。从20世纪70年代开始，以灯盏花总黄酮为原料的灯盏花制剂广泛应用于临床治疗，临床实践其具有多种疗效且疗效好、安全性高，尤其是在治疗心脑血管疾病方面，其总有效率达88.3%[3，4]。由于长期全靠野生采挖, 灯盏花资源及其生态环境遭到很大的破坏，野生资源日益减少[5]。为解决灯盏花药材的资源短缺，自2002年云南开始进行灯盏花的人工栽培[6]。由于目前对灯盏花相关遗传研究的滞后及其遗传背景狭窄，杂交育种的难度较大[7]，目前尚无灯盏花栽培品种的报道，栽培种源均为野生筛选株系的繁殖后代或组培快繁后代[8，9]，后代稳定性较差，给灯盏花规模化栽培及GMP管理带来一定的难度。从植物系统学上寻找其相近物种，一方面有利于寻找新的替代资源，另一方面有利于药用植物的杂交育种。利用植物亲缘学，已从国内植物中寻找到沉香(Aquilaria agallocha)、马钱(Strychnos nux-vomica)、大风子(Hydrocarpus anthelmintica)、胡黄连(picrorrhizakurroa)等的替代品[10]。利用DNA序列同源性比较、探讨植物的系统演化及分类已成为当前植物分类及系统演化的一种重要手段[11]。目前常用于分类研究的基因片段有：叶绿体基因组的matK 基因、rbcL基因、ndhA, D基因, 核基因组有18S rDNA、和ITS(Internal transcribed spacer核糖体内转录间隔区)[12]，其中ITS位于植物18S和26S之间被5.8S分隔成ITS 1和ITS2 2个区域，由于进化速度较快、稳定性好和测序方便等特点，已成为研究植物系统发育及分子进化的有效工具[13~15]。本文以云南丘北的灯盏花为材料,对其rDNA ITS序列进行了克隆及序列测定，并将其与相关植物的序列进行比较分析，旨在探讨其属间的遗传变异以及它们之间的亲缘关系，为灯盏花的育种奠定基础。
1材料 灯盏花为采自云南文山丘北的野生材料，材料编号为E06。DNA提取试剂盒、dNTP、TaqDNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司。
2方法 2.1DNA的提取以新鲜灯盏花叶片为试材，参照Rodrigues的方法进行表明消毒[16]，取叶片0.1 g,加液氮研磨成细粉后，按天根生化科技(北京)有限公司 RNeasy Mini Kit实验操作步骤进行DNA制备。
2.2ITS的PCR扩增和产物纯化按通用引物：F(5’-3’)TCCGTAGGTGAACCTGCGG,R(5’-3’) TCCTCCGCTTATTGATATGC对ITS 区进行扩增。 PCR扩增按以下操作进行：在每个0.2ml的离心管中加入5 μl PCR缓冲液(10×)、1 μl dNTPs(10 μmo1·L-1)、1 μl引物R (100 μmol·L-1)、1 μl引物F(100 μmol·L-1)、2 μl DNA模板、0.5 μl Taq DNA聚合酶(2 U·μl-1)及39.5μl无菌双蒸水，于94℃中变性3 min，然后按94℃ 30 s,50℃ 1 min，72℃ 2 min进行40轮的循环反应，最后在72℃下延伸5 min。用含有EB的1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，Gel Doc2000凝胶成像系统观察并贮存图像。天根生化科技(北京)有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA。
2.3PCR产物的克隆测序经琼脂糖凝胶电泳检测无非特异性条带PCR 产物后，按天根pGM-T 载体试剂盒提供的方法进行连接，然后转染到感受态细胞DH5α中，采用蓝白斑筛选法，挑取白色菌落进一步扩繁，提取质粒。质粒鉴定以提取质粒为模板，用引物T7：TAATACGACTCACTATAGGG，SP6：ATTTAG GTGACACTATAG 对质粒进行PCR扩增。反应体系同目的片断扩增体系，PCR 程序为：预变性94℃，3 min;变性94℃，30 s;退火55℃，30 s;延伸72℃，40 s;循环30次;最后延伸72℃ 6 min。重组质粒的序列测定委托天根生化科技(北京)有限公司，DNA序列的排序用 DNAstar 软件包完成。测序结果通过国际生物技术信息中心网站(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析其基因同源性分析。
2.4rDNA 序列与系统发育分析所测序列经校对后与从GenBank下载的序列利用DNAStar软件包进行多重比对分析。根据比对结果和Blastn的分析结果, 分别确定ITS1和ITS2的分界,去掉两端的18S、28SrDNA的部分序列和5.8S序列。将所得ITS序列与从NCBI数据库中调出的ITS序列用MEGA4软件进行对比分析，同时利用MEGA4软件处理构建核苷酸组成比例。
3结果及分析 3.1灯盏花ITS序列的扩增用引物T7：TAATACGACTCACTATAGGG，SP6：ATTTAGGTGACACTATAG 对克隆质粒进行PCR扩增，得到长度大约为700bp的扩增产物(图1)。对克隆进行序列测定(图2)，灯盏花E6的rDNA片段包括ITS1，5.8S和ITS2全长序列以及18S，26S部分序列，总长度为671 bp，序列注册号为AF494003。根据已报道的短葶飞蓬rDNA序列(GenBank: AY370907.1)确定rDNA转录间隔区ITS1和ITS2及3个编码区18S，5.8S和26S的界限，发现其5.8S全长为164bp，ITS1与ITS2的长度分别为264 bp和243 bp。将E6的rDNA与目前已注册相关近源种进行碱基含量比较(表1)，发现灯盏花与近源属相关种E.subtrinervis,E.morrisonensis，E.bellidiastrum，G.coriacea，A.tataricus，V.texana等不仅在长度上存在一定的差异，而且在A、T、G、C的含量分布上也有一定的差异，即使同属的E.subtrinervis，E.morrisonensis，E.bellidiastrum，E.breviscapus间也存在差异，而且这种差异与其他属及其他属间的相关种间的差异没有差异。表明在物种演化过程中，rDNA的变化除点突变外，还可能发生碱基的插入或缺失，从而使不同物种中的rDNA存在长度的差异。同时在碱基的替换上没有明显的规律性。图1灯盏花r DNA电泳图表1灯盏花E6 rDNA与近源物种碱基组成的比较
3.2不同灯盏花居群的ITS比对用MEGA对灯盏花不同居群的ITS进行对比，发现居群间ITS序列同源性差异不明显(图2)(序列中星号代表无差异位点)，除掉首尾两端过长的序列后(图2)，序列的其余部分几乎完全相同，除第199与618两位点的核苷酸表现出差异外，其他位点完全相同。其中AF494003与AY370907、AY370901、AY370900、AY370896、AY370895、AY370894在第209位点为A，其余的都为G;第628位点除AY370899为T外，其余都为C。表明利用rDNA序列变化检测灯盏花居群间变化是无效的。进一步将灯盏花的ITS1、5.8S、ITS2及全rDNA序列与菊科其他3个属12个种的相应序列进行比对，发现其同源性分别为71.1%，98.59%，67.25%及70.7%(图3)。表明5.8S基因在物种演化中非常保守，而ITS1和ITS2变异及较大，ITS1、ITS2及rDNA序列可用于属内种间的鉴别，而5.8SrDNA序列可用于科内属间的鉴别。
3.3系统树构建图将灯盏花ITS1、5.8S、ITS2与菊科3个属11个种进行序列对比(图3)，并依次构建其系统发生树(图4、图5、图6)，结果发现3个系统发生树所得结论并不完全一致。图4中显示飞蓬属的3个种(E.subtrinevis、E.moniscensis var.fukuyamee、E.belliidstrum)聚在一起，而灯盏花(E.breviscapus)则与紫苑属的两个种(A.tataricus，A.glehnii)聚在一起;图5中飞蓬属的4个种都聚在一起，同时紫苑属的3个种均聚在一起;图6中3个飞蓬属相关种与紫苑属的两个种聚在一起，紫苑属的一个种与灯盏花聚在一起。表明利用rDNA的不同区域进行系统发生构建时会产生不同的结果，但从几个图中都反映出飞蓬属与紫苑属更为接近。因此，在利用分子生物学手段进行系统发生树时，应采用多个基因或DNA序列进行对比分析，这样才能使所建立的发生树更接近真实情况。从图4~5中还可发现一个有趣的现象，灯盏花与飞蓬属的其他物种均有一定的差异。飞蓬属(Erigeron L.)作为一群广泛分布的植物，全球分布共200种，仅我国就有33种，各地皆产(飞蓬属：植物通
http://www.plant.ac.cn/latin/Compositae/Erigeron.htm)。但仅短葶飞蓬的分布限于我国西南高山地区，灯盏素目前也仅发现于灯盏花。说明灯盏花在其演化过程中有可能发生在其次生代谢(特别是黄酮代谢)上发生过重大变化以适应高山环境，因类黄酮可保护植物应付阳光中的UV辐射[17，18]。因此，在寻找灯盏花的替代植物及杂交亲本中，除考虑其系统学的亲缘关系外，还应考虑其生态地理分布。图2不同灯盏花集群的ITS序列的同源性比对a-为ITS1序列比对的部分结果;b-为5.8S序列比对的部分结果c-为ITS2序列比对的部分结果;d-为ITS序列比对的部分结果图3菊科3个属12个种的ITS1、ITS2、5.8S及rDNA的序列比对目前国内对飞蓬属的研究大多集中在短葶飞蓬上，而对飞蓬属其他植物的研究不多，利用发生树(图5)所寻找到与灯盏花最为接近的E.moniscensis var.fukuyamee在国内未见报道。因此，下一步应加强对飞蓬其他植物的研究以便寻找到与飞蓬属更为接近的植物，或作为育种亲本，或作为替代植物。图4ITS1构建的系统图图55.8S构建的系统图图6ITS2构建的系统图图7ITS构建的系统图
3结论 本文通过对灯盏花新鲜植物叶片总DNA的提取，利用真核生物通用引物扩增rDNA ITS区序列，分析了灯盏花及其近源物种间rDNA 序列变异关系及其规律，不仅为探讨其属间的遗传变异以及它们之间的亲缘关系奠定基础，同时也可为下一步灯盏花替代资源和育种亲本的寻找奠定基础。从实验中可以发现，灯盏花居群间r DNA的变异较小，因此利用r DNA是无法判断居群间的差异。但利用ITS1、5.8S、ITS2及r DNA序列将灯盏花与菊科其他3个属12个种的相应序列进行比对，发现其同源性分别为71.1%，98.59%，67.25%及70.7%，说明利用ITS1、ITS2和r DNA序列完全有可能判断到属内种间的差异。这与Ainouche & Bayer, 1997;Kollipara et al.,1997等的研究结果一致[19，20]。
尽管利用ITS1、ITS2及r DNA对灯盏花与相关物种所构建的系统图有所不同，但从中可看出灯盏花在物种演化中可能是一个特例，同时也表明飞蓬属与紫苑属的关系更为密切。因此，在灯盏花替代资源和育种亲本寻找时，除考虑物种的亲缘关系外，还要考虑物种的分布特异性，最好寻找高山分布的飞蓬属或紫苑属的植物。此外，由于本文所采用的飞蓬属植物均为国外分布物种，在以后的工作中应加强对中国飞蓬属植物的研究以便将来有可能寻找到灯盏花替代资源和育种亲本。
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