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       【摘要】 
       目的观察脾阳虚模型大鼠小肠黏膜肽转运载体1(PepT1)的表达及其转运功能的变化。方法采用劳倦泄下合利血平复合因素造模法建立脾阳虚大鼠模型，RP-HPLC法测定cefalexin血药浓度以评价小肠黏膜PepT1的转运吸收功能，免疫组化方法观察脾阳虚大鼠肠上皮PepT1蛋白表达情况。结果十二指肠给药120 min后，RP-HPLC法测定模型大鼠血清cefalexin浓度为(5.23±2.10) μg/ml，高于正常对照组的(2.52±0.47) μg/ml(P<0.01);模型大鼠小肠黏膜上PepT1蛋白表达较正常对照大鼠表达升高。结论脾阳虚证模型大鼠小肠黏膜肽转运载体PepT1表达及对cefalexin的转运能力增强。
       【关键词】  脾阳虚证;动物模型;肽转运载体1
       Abstract：ObjectiveTo observe the expression and transport ability of PepT1 protein in model rats of spleen-"yang" deficiency.　　MethodsThe model spleen-"yang" deficiency rats was established by the way of over exertion, purgation combined with reserpine injection. Transport ability of PepT1 for cefalexin was determined by RP-HPLC. Immunohistochemical technique was performed to detect the expression of PepT1 protein in mucous membrane of small intestine.ResultsAfter 120 minutes administration through duodenum injection, serum cefalexin concentration of model rats was (5.23±2.10) μg/ml, higher than that of control group, (2.52±0.47) μg/ml. The PepT1 protein expression level in small intestine mucosa of model rats was higher than that of control group.　　ConclusionCompared to control group, the expression and transport ability of PepT1 in model rats of spleen-"yang" deficiency was increased.
       Key words： Syndrome of spleen-yang deficiency;Model rats;Peptide transporter 1
       肽转运载体1(peptide transporter 1，PepT1)是消化道中蛋白质降解产物二肽、三肽吸收和转运的主要载体[1]。 β-内酰胺类抗生素( β-lactam)在肠道内的吸收机理与二肽一样，主要通过小肠上皮细胞PepT1转运[2]。 β-内酰氨类抗生素头孢氨苄(cefalexin)分子结构相对稳定，在血液内容易检测，在肠道吸收后因没有相应降解酶而以几乎不被降解的状态进入血液，血液中的头孢氨苄浓度可以在很大程度上反映肠道PepT1吸收转运的能力[3]。 PepT1主要位于小肠黏膜上皮细胞刷状缘膜囊(Brush-Border Membrane Vesicles，BBMV)上，通过免疫组化方法可以观察到大鼠小肠黏膜上PepT1蛋白表达情况。本实验试图通过此两方面的研究来观察脾阳虚证模型大鼠小肠黏膜上PepT1的蛋白表达及其吸收能力变化。
       1材料与仪器
       1.1动物雄性SD大鼠20只，体质量200～220g，广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2003-0002，粤鉴证字2007A003;适应性饲养1周后开始实验。
       1.2试剂和药物利血平注射剂(广州邦民，060612)，头孢氨苄胶囊(中国石药)，头孢氨苄标准品(Sigma，纯度>99.9%);甲硝唑对照品(中国药品生物制品检定所);甲醇(色谱纯，Merck，德国);乙腈(色谱纯，Merck，德国);水为Milli-Q超纯水。
       1.3设备TSQ Quantum(Thermo Scientific)，Finnigan Surveyor Plus 高效液相色谱系统(Xcalibur2.0工作站)，高速冷冻离心机(Sigma，美国)，RVC2-18真空浓缩离心仪(Christ，德国)，XR205SM-DR电子天平(Precisa，瑞士)，水浴振荡器(培英SHZ-88A)。
       2方法
       2.1动物分组与造模方法将大鼠随机分为正常对照组和模型组，每组各10只。采用劳倦泄下合利血平复合因素造模法建立脾阳虚大鼠模型[4]。造模组大鼠见有明显消瘦，活动减少，扎堆，蜷缩，大便稀溏，肛周有污物，毛色枯槁不荣。造模大鼠摄食量、体质量和肛温及D-木糖排泄率均显著性降低(与正常大鼠比较均P<0.01)，确认模型建立。
       2.2标本采集头孢氨苄胶囊去囊后用双蒸水配成5 mg/ml水悬液，超声混匀。每只大鼠以戊巴比妥纳60.0 mg/kg体质量剂量腹腔注射麻醉，开腹结扎幽门部，从幽门下十二指肠处进针，缓慢注入5.0 mg/ml头孢氨苄水溶液2.0 ml，缝合腹腔(见图1)。给药后120 min眶静脉采血，1 200 g×离心15 min采集血清，-20℃保存备用;随机选择模型组大鼠和正常对照组大鼠各6只，处死后立即在幽门下20.0 cm处剪取2.0 cm左右小肠段，4℃生理盐水清洗后中性甲醛固定20 h，用于PepT1 蛋白免疫组化检测。
       2.3大鼠Cefalexin血药浓度的测定称取头孢氨苄标准品2.0 mg，溶于2.0 ml超纯水中，配成浓度为1.0 mg/ml母液。备7个500 μl离心管，取396 μl空白血清至第1管，余管均加入200 μl，在第1管中加入4 μl头孢氨苄母液，混匀后取出200 μl加入第2管，混匀后再依次以上操作至第7管，余200 μl弃去;各样品血清取200 μl。标准管和样品管中均加入超纯水40 μl，乙腈300 μl，混匀后4 115 r/min离心5 min，取上清;加入二氯甲烷4 ml，振荡15min，取水相上清100 μl，进样测定浓度。HPLC条件：色谱柱为Hypensil Gold(150 mm×2.1 mm，3.0 μm)，流动相为甲醇∶水(30∶70)，流速 0.4 ml/min，柱温26℃。图1大鼠十二指肠内给药路径示意图[5]
       2.4脾阳虚大鼠肠上皮PepT1蛋白表达的观察
       2.4.1试剂材料及器械试剂：石蜡1(熔点54～56℃)，石蜡2(熔点56～58℃)，95%酒精，无水乙醇，二甲苯，丙酮，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，氯化钠，柠檬酸，柠檬酸钠，APES(武汉博士德)，丙酮，二甲苯，工业用酒精，30%过氧化氢(H2O2)，甲醇，苏木素，中性树胶，PEPT1-rabbit antibody(Santa cruz)，HRP-goat anti-rabbit IgG(Proteintech Group)，牛血清白蛋白，DAB染色剂。材料：盖玻片，载玻片，玻片架，玻片盒，塑料包埋框，铅制包埋格。器械：孵育箱，电炉，高压锅，干燥烘箱，电子显微镜。
       2.4.2试剂配制①固定液(中性甲醛)：100 ml甲醛原液+4.0 g磷酸二氢钠+6.5 g磷酸氢二钠，加双蒸水定容至1 000 ml。② 0.01mol/L的PBS(以下简称PBS)：0.296 4 g磷酸二氢钠，2.9 g磷酸氢二钠，8.5 g氯化钠加双蒸水至1 000 ml;③ 0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液：0.4 g柠檬酸，3 g柠檬酸钠加双蒸水至1 000 ml。④ 3%过氧化氢甲醇：1份30%过氧化氢+9份甲醇原液。⑤ 2%的APES丙酮：1份APES+49份丙酮原液。⑥ 以自来水配制100%(工业酒精原液代替，以下如此类推)、90%、80%、70%、50%、30%的酒精。⑦ 1%和5%的牛血清白蛋白：0.01 mol/L的PBS加固体的牛血清白蛋白配制。
       2.4.3实验步骤
       免疫组织化学反应：固定后组织块置于包埋框内，依次放入75%酒精脱水2 h，85%酒精2h，90%酒精1 h，95%酒精1 h，无水酒精45 min，丙酮和无水乙醇按1∶1混合的液体20 min，100%“二甲苯1”30 min，100%“二甲苯2”30 min; “石蜡1”和“石蜡2”两缸(装在1L大烧杯内)提前24 h放入烘箱内80℃使其融化(反复溶解3次使用)，使用时温度降至60℃。将包埋框放入“石蜡1”的缸中45 min，然后放入“石蜡2”的蜡缸中30 min;包埋后切片;切片放入烘箱55℃烤片2 h，自然冷却后浸泡二甲苯10 min×2次;分别把经二甲苯脱蜡的载玻片浸泡在100%，90%，80%，70%，50%，30%酒精中各2 min，流动的清水冲洗5 min，PBS洗5 min，3%过氧化氢-甲醇溶液浸泡3min，灭菌双蒸馏水洗5 min，PBS洗5 min×2次;用0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液充满玻片盒(离上限约1 cm)，在微波炉内加热至沸腾，同时加热高压锅内水至沸腾;把玻片放入枸掾酸盐缓冲液中转移至高压锅内，高压锅拧紧盖子，喷气后计时40 min。拿出玻片盒，自然冷却。冷却至室温后先蒸馏水洗(在摇床中轻摇5 min)，然后PBS洗5 min;滴加5%的牛血清白蛋白在波片上封闭2 0 min，甩去血清;滴加1∶40的PEPT1 rabbit-antibody(1%的牛血清白蛋白稀释)20 μl，置湿盒内，4℃冰箱过夜;PBS洗5min×3次，滴加1:50的goat anti rabbit IgG(1%的牛血清白蛋白稀释)20 μl，湿盒内室温下放置1.5 h，PBS洗5min×3次;滴加DAB液50 μl，镜下观察显色，8 min时用自来水柔和冲洗，停止反应。苏木素染色30s，自来水冲洗5 min;二甲苯和中性树胶按1∶1稀释，滴在玻片上，盖上盖玻片。电子显微镜下拍照。IOD值的Image-Pro Plus 5.0图像分析系统测定：使用Image-Pro Plus软件打开免疫组化照片，统计数据以获取图片中所有选中区域的平均面积、平均光密度值，平均直径、累积光密度值，每个样本拍摄5个不同区域。
       2.5统计方法所得每组数据用±s表示，使用SPSS 11.0软件包单因素方差分析和t检验，P<0.05差异有统计学意义，P<0.01差异有显著性统计学意义。
       3结果
       3.1cefalexin血药浓度的RP-HPLC法测定实验3周末时正常对照组与模型组大鼠cefalexin血清按照上述方法测定。结果见表1。模型组大鼠血药浓度与正常对照组比较有显著性升高(P<0.01)。表1大鼠血清cefalexin浓度
       3.2免疫组化染色IOD结果正常对照组与脾阳虚模型组大鼠小肠黏膜上PepT1经染色后表现，见图2。模型大鼠小肠黏膜上PepT1蛋白表达较正常对照大鼠表达升高(P<0.01)。结果见表2。图2两组大鼠免疫组化PepT1染色表2PepT1免疫组化检测结果
       4讨论
       二肽、三肽通过BBMV上PepT1的转运在人类小肠蛋白同化过程中起到主要作用[6]，已有研究认为小肽(二肽、三肽)可直接被动物机体吸收并在细胞内作为合成蛋白质的底物，并可能在健康人或胃肠疾病患者中，小肽吸收比自由氨基酸更具有动力学优势。有研究认为，在小肠吸收功能出现障碍或整体蛋白质营养吸收低状态下，二肽转运比氨基酸转运更有效率[7,8]。二肽、三肽比自由氨基酸吸收更有效率的原因，可能是因为三肽-钠结构能使氮滞留，这样在小肠吸收低状态下特别有用[9];也可能是肽转运系统比自由氨基酸转运系统拥有更大的转运容量：肠道氨基酸的吸收主要是通过易化扩散，而二肽的吸收主要是依靠活跃的阴离子交换过程;并且通过对蛋白水解物口服液和晶状二肽的研究，从小肽解离的氨基酸比自由氨基酸再吸收率更大并更稳定[6]。
       PepT1蛋白是小肠粘膜上皮细胞吸收二肽、三肽的转运载体，其表现功能蛋白的位置是在刷状缘膜囊上[10]。PepT1对小肽的转运目前认为是蛋白质吸收的主要途径之一。通过观察脾阳虚大鼠小肠黏膜上PepT1蛋白质表达及转运功能的的变化，对于脾阳虚证实质的深入理解和温阳健脾法具体到作用靶点的研究，对脾阳虚证治疗的客观化研究有一定的意义。
       本实验结果可见，脾阳虚证模型大鼠PepT1转运功能、蛋白表达水平均处于增强状态。脾阳虚证状态下，脾主运化功能障碍，小肠对营养物质的吸收转运功能降低，但是PepT1转运增加，本实验验证了这一理论。小肠吸收细胞对二肽的转运作为小肠占主导的氨基酸转运在病理状态下的有效补充，可以对小肠氨基酸转运不足导致的蛋白质营养不良进行矫正。
       【参考文献】
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