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       【摘要】 
       目的观察外燥对小鼠肺组织水通道蛋白1(AQP1)表达的影响。方法60只SPF级昆明种小鼠随机分为常温常湿组、常温燥组、温燥组、凉燥组，每组15只。图像分析免疫组化法之各组第6天、第12天，第18天小鼠肺组织AQP1阳性表达率。结果各组AQP1阳性表达部位多在肺泡上皮处;温燥组第12天、第18天AQP1蛋白表达阳性率持续下降，凉燥组也呈同样趋势，尤以第12天为甚(P<0.01)，伴肺部炎性病变并随时间延长而加重。结论外燥致肺部炎性病变之时，伴肺泡液细胞内外转运相关的AQP1蛋白表达下降，提示与外燥伤肺、耗津病机相关。
       【关键词】  外燥;小鼠;肺;水通道蛋白1
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of External dryness Aquaporin 1(AQP1) in lung tissue of mice .Methods60 Kunming mice(SPF) were divided into group A(normal)，group B(normal temperature and external dryness),group C(warm-Dry), group D (Cool-Dry),15 mice in each group.The expression of AQP1 was detected on day 6,12 and 18.ResultsCompared with group A, the positive expression of AQP1 was located in the membrane edges of alveoli,and the positive rates of AQP1 in group C and D were remarkably lowered on day 12 and 18(P<0.01)as the evident inflammations of lung.ConclusionThe dearease of AQP1 expression is related with the damage of alveoli in external dryness.
       Key words： Outer-Dry; Mice; Lung;Aquaporin 1
       在哺乳动物体内发现13种能介导水的快速跨膜运动的非选择性细胞膜水通道蛋白(Aquaporin,AQP)[1，2]，AQP在肺、肾和消化系统等广泛存在，体内津液代谢主要与肺、脾相关，提示AQP为津液输布的生物学基础之一。文献报道小鼠细菌内毒素诱导急性肺损伤4～12 h明显肺水肿时，肺泡AQP1表达明显减少，第14天肺水肿减轻时，肺毛细血管内皮细胞及间质细胞AQP1表达有所恢复[3]。在外燥可致小鼠气道、肺组织病变基础上，本实验动态观察外燥对小鼠肺组织AQP1蛋白表达的影响和与肺部病理改变的相关性。
       1材料
       1.1试剂和仪器LRH-250人工智能气候箱(广东医疗器械厂)，温度：(30～65)℃±1℃，相对湿度：(30%～90%)±3%)。LG风扇程控仪(MASTER-K30H，韩国)。兔抗小鼠AQP1多克隆抗体试剂盒(DA0648，200902，武汉博士德公司)，咔唑(054K078，Sigam)、D-葡萄糖醛酸内酯(2711EC，Sigam)，其余试剂均为分析纯。
       1.2动物无特定病原体级(SPF)昆明种小鼠60只，体质量(17±1)g，雌雄各半，湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2008-2005。
       2方法
       2.1动物分组与造模60只昆明种小鼠随机分为常温常湿组、常温燥组、温燥组和凉燥组，每组15只，置人工气候箱内常规饲养，按文献造模[4]。处理后第6天、第12天、第18天检测相关项目。小鼠实验前4 h常规禁食、禁水。
       2.2普通病理组织学观察断颈处死小鼠，取右肺中叶组织2 cm×2 cm，常规HE染色，镜检。
       2.3AQP1蛋白表达检测采用免疫组织化学法。取各组第6天、第12天、第18天小鼠右肺组织(0.5 cm×0.5cm)，常规固定、包埋切片，微波法热修复抗原，依次滴加羊抗鼠AQP1多克隆抗体、生物素化兔抗羊二抗和SABC，DAB显色，苏木素衬染、透明封片。光镜下以肺泡周围及肺泡上皮出现棕色颗粒为阳性，JEDA80ID图像分析软件计算AQP1阳性表达“平均灰度”与“异形指数”，并按下式计算：AQP1表达阳性率(%)= 肺组织AQP1阳性染色面积 /肺组织总面积×100%
       2.4统计学处理实验数据以±s表示，采用SPSS13.0软件，资料之间比较用ANOVA分析，显著性检验采用多个样本均数间q检验(Newman-Keuls法)，P<0.05认为差异有统计学意义，检验水准为双侧α=0.05。
       3结果
       3.1病理观察常温常湿组各期无异常，常温燥组第12天肺部轻度充血;温燥组、凉燥组第6天肺泡充血、肺泡隔增厚与炎性细胞浸润，第12天、第18天肺泡瘀血加重，伴明显肺气肿现象，肺泡隔处明显增厚伴炎性细胞浸润，凉燥组肺泡纤维素沉积现象较其他组严重。
       3.2外燥对小鼠肺组织水通道蛋白1(AQP1)表达的影响见表1。
       3.3外燥对鼠肺组织水通道蛋白1(AQP1)表达“平均灰度值”的影响见表2。
       4讨论
       三维晶体学方法证实，哺乳动物AQP1通道管上His182、Arg197、Phe58和Cys191 4个氨基酸残基构成的狭口恰好是一个水分子的大小，1个AQP1分子每秒钟允许30亿个水分子通过。成人每侧肺内约有3~4亿个肺泡，肺泡Ⅰ型细胞覆盖93%的肺泡表面，肺泡Ⅱ型细胞功能之一是合成与分泌表面活性物质，参与保持肺间质水分恒定和肺泡处于相对湿润状态。Song等采用免疫组化染色技术发现，AQP1可表达于肺泡Ⅱ型上皮细胞顶膜面，免疫电镜显示肺泡Ⅰ型细胞的腔膜面及基侧膜面、肺泡Ⅱ型细胞微绒毛表面呈高电子密度阳性反应。实验证实AQP1基因剔除小鼠肺泡毛细血管间水渗透性较野生型小鼠低10倍;小鼠肺部病毒感染后明显肺水肿时，肺泡AQP1表达明显减少，肺水肿减轻则有所恢复，提示AQP1减少可能是水肿液肺间质聚集的主要原因[5]。
       本结果显示，AQP1蛋白阳性表达多在肺泡上皮和肺泡膜缘，与文献报道相符。常温常湿组第6天、第12天与第18天肺组织AQP1表达阳性率相对恒定，常温燥组第12天、第18天下降(P<0.01)，凉燥组也呈同样趋势。温燥组第6天AQP1表达变化不明显，但第12天、第18天则持续下降，提示第6天AQP1为代偿性增加以维持肺局部之水液转运功能;但随病程延长其代偿功能随之减弱，并与同期该组肺组织之明显病理改变相关。表1外燥对小鼠肺组织水通道蛋白1表达的影响表2外燥对小鼠肺组织AQP1表达“平均灰度值”的影响数字图像的灰度值是某一点的亮度或色彩在给定亮度或色彩序列中次序的数值，观测“平均灰度值与”异形指数“以辅助了解AQP1在肺组织的表达状态。与常温常湿组比较，虽然常温燥组第6天AQP1阳性表达部位之”平均灰度值较低，同期AQP1表达阳性率显著降低(P<0.01)，但温燥组、凉燥组第6天至第18天AQP1表达平均灰度值未见改变，提示本实验采用的免疫组化方法较为稳定。
       值得关注的是，常温燥组第6天、第12天与第18天AQP1表达阳性率持续明显下降之时，其“异形指数”相对稳定;温燥组第6天AQP1表达阳性率代偿性增加时，其“异形指数”相应增加，以第12天为甚(P<0.05)，而凉燥组第6至第18天AQP1表达阳性率持续明显下降之时，其“异形指数”则呈增加趋势，尤以第12天为甚(P<0.05)。同期病理组织学观察显示，温燥组、凉燥组第6天肺泡瘀血、纤维素沉积、肺泡隔增厚与炎性细胞浸润，伴“肺气肿”现象，且多在第12天为重，显示AQP1在肺组织阳性之特点。本结果表明，燥劫肺津，气不布津则肺系组织失之濡润;与肺泡液细胞内外转运相关的AQP1蛋白表达下降，并与肺部炎性改变相关，提示肺泡腔、肺呼吸膜及和血管腔间水液转运稳态失衡而致肺部病变，与外燥病机相关。AQP1与燥邪伤肺病机之特征性评价指标的相关性值得研究。
       【参考文献】
         [1]ZeleninaM, Zelenin S, Aperia A. Water channels ( aquaporins)and their role for postnatal adap tation [J].Pediatr Res, 2005, 57(5 Pt 2):47.
       
       [2]胡利群，丁建中.水通道蛋白与肺部疾病研究进展[J].长江大学学报(医学版)，2008，5(4)：83.
       
       [3]李波，陈东，王桂芳，等.水通道蛋白1、3 、4 、5在内毒素性急性肺损伤小鼠肺组织中的表达[J].第二军医大学学报，2008，29(2):131.
       
       [4]丁建中，张六通，龚权，等.温燥致病机制的实验研究[J].中医杂志，2007，48(11)：1024.
       
       [5]Towse J E, Harrod K S, Krane C M,et al. Decreased exp ressionof AQP1 and AQP5 in mouse lung after acute viral infection[J]. Am J Resp ir CellMol Biol, 2000, 22:34.