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       【摘要】 
       目的探讨补肾化痰法对AD模型大鼠Tau蛋白异常磷酸化的影响。方法应用脑立体定向技术给大鼠Meynent基底核注射凝聚态Aβ25-35+IBO构建AD模型。注射2周后，高、中、低量组分别给大鼠该药水煎液灌胃;西药组用哈伯因混悬液灌胃;正常组、空白组、模型组均给予等容积的生理盐水灌胃。28 d后采用蛋白免疫印迹法检测海马匀浆中Tau蛋白磷酸化总量。结果正常组与空白组海马区Tau蛋白磷酸化水平无明显差异(P>0.05)，模型组海马区Tau蛋白磷酸化水平显著增加(P<0.01)，给药后发现不但大鼠海马组织Tau蛋白异常磷酸化水平下降，高、中量组与模型组比较显著降低(P< 0.01)，与西药组也有差异(P<0.01) 。结论补肾化痰法可以降低Tau蛋白异常磷酸化水平，从而发挥其抗老年性痴呆的作用。
       【关键词】  阿尔茨海默病;Tau蛋白;补肾化痰法
       阿尔茨海默病(Alzheimer"s disease,AD)是一种以进行性记忆障碍和智能衰退为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病，随着人口老龄化的日趋严重，AD已经成为危害老年人健康的主要疾病之一[1]。AD患者的特征性病理改变包括神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangle,NFT)、老年斑(Senile plaques ,SP)和颗粒空泡变性。NFT在神经元胞体内，由高度磷酸化的Tau蛋白聚集形成，其数目和AD的痴呆程度密切相关，因此有人认为Tau蛋白的过度磷酸化是AD 的核心病变[2]。本实验观察了补肾化痰法对AD模型大鼠Tau蛋白异常磷酸化的影响，以探讨补肾化痰法对AD神经保护作用机制。
       1材料与仪器
       1.1药物补肾化痰方由制首乌、石菖蒲、竹节参、茯苓、陈皮、半夏、白芥子等组成,购自湖北中医学院国医堂门诊部。中药经水煎制成浓缩液。哈伯因,河南众生制药股份有限公司豫中制药厂产品，批号:060321。
       1.2试剂Aβ25-35和IBO购于Sigma公司，免疫印迹化学发光试剂(ECL)、BCA蛋白浓度检测试剂盒、预染的蛋白Marker、PVDF膜、蛋白提取试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。兔抗大鼠磷酸化Tau抗体(PHF-1) 购自abcam 公司，HRP标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。
       1.3仪器电泳仪(DYY-4C)、垂直电泳槽、电转移槽、凝胶成像扫描仪均为北京六一仪器厂生产。
       2方法
       2.1动物及分组15月龄Wistar大鼠70只，雌雄各半，体质量(450±50)g，随机分为7组，每组10只。由湖北省实验动物研究中心提供。实验分组：①Aβ25-35+IBO模型组(简称模型组);②假手术组(简称空白组);③正常组;④哈伯因治疗组(简称西药组);⑤补肾化痰法高剂量组(简称高量组);⑥补肾化痰法中剂量组(简称中量组);⑦补肾化痰法低剂量组(简称低量组)。
       2.2AD模型构建模型组大鼠用 2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上，颅顶正中切开暴露至颅骨，根据大鼠颅脑立体定位图谱，对基底核立体定位(位置:前囟后 3.8 mm，中线旁开 2.5 mm，深度 3 mm)，用牙科钻钻开颅骨，用 1μl 微型进样器注射针5 min 内缓慢注入Aβ25-35+IBO混合液 1 μl，予以留针 10 min。注射完毕后以局部软组织封闭针孔，缝合皮肤。术后给予青霉素钠盐 5 万u肌注，1次/d，连续 3 d。空白组在定位下给予大鼠meynert基底核一次性注射 1 μl 灭菌生理盐水。
       2.3给药脑内注射2周后给药。给药量均按人与大鼠体表面积系数比确定，以临床人用药等效剂量做为中剂量，模型组、空白组、正常组给予生理盐水灌胃，1 ml·(100 g)-1·d-1，连续28 d。西药组给予哈伯因混悬液灌胃，1 ml·(100 g)-1·d-1，连续28 d。高量组、中量组、低量组分别给予补肾化痰方水煎液灌胃，含生药分别是2 g·ml -1，1 g·ml-1，0.5 g·ml-1，1 ml·(100 g)-1·d-1，连续28 d。
       2.4取材动物水迷宫后断头，冰台上迅速取脑，分离海马组织一部分放入液氮速冻。
       2.5Western blot 检测大鼠海马组织Tau蛋白异常磷酸化
       2.5.1组织中总蛋白的提取①从液氮中取50 mg海马组织块，尽量剪碎组织块;②放入匀浆器中，加入400 μl缓冲液(含PMSF)，然后置于冰上进行匀浆;③4℃下12 000 r/min离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于-20℃保存。
       2.5.2蛋白含量的测定①取1.5 ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1 ml。室温放置30 min后用于测蛋白。②取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2 min做检测空白样品。③取一管考马斯亮蓝加95 μl 0.15 mol/L NaCl溶液和5 μl待测蛋白样品，混匀后静置2 min，检测样品。
       2.5.3SDS-PAGE凝胶电泳①安装玻璃板 ②加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌10%分离胶时，用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度。小心在分离胶上覆盖一层水，以隔绝空气。③当水和凝胶之间出现一条清晰的线条时，说明凝胶已聚合。倒去水并用吸水纸将水吸干。④加入TEMED后立即摇匀灌胶。将剩余空间灌满4%浓缩胶，立即将梳子插入浓缩胶中。如有气泡，拔除梳子重新灌制。室温垂直静置，等待聚合。⑤用水冲洗浓缩胶，将其放入电泳槽中。⑥加入已煮沸变性的蛋白样品，上样量一致。⑦在电泳槽中加入1×电泳缓冲液。电泳时间4～5 h，电压为40V。电泳至溴酚蓝刚跑出终止电泳，进行转膜。
       2.5.4转膜①切取6张大小一样的滤纸，其大小与转印区域一样。然后，把它们浸泡在电转缓冲液中。切取同样大小的一张PVDF膜，轻轻置于有超纯水的平皿里浸2 h。②在PVDF膜上垫3张滤纸，然后将凝胶平铺于PVDF膜上，再放上3张滤纸，用玻棒在滤纸面上滚动除去各层气泡，然后放入电转仪内，用60V转移2 h。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。③转完后将膜用1×丽春红染液染5min。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。
       2.5.5免疫反应①将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。②倾去封闭液，加入用TBST稀释至适当浓度(在1.5 ml离心管中)的一抗;室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min;再用TBS洗一次，10 min。③同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min;再用TBS洗一次，10 min，进行化学发光反应。
       2.5.6化学发光，显影，定影①将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;1 min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触;1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。②在暗室中用X胶片感光、显影及定影。③用凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
       2.6统计学处理所有计量检测结果以±s表示。采用SPSS FOR WINDOWS 15.0统计软件包统计分析。
       3结果
            本实验测定了各组大鼠海马磷酸化Tau蛋白含量, 统计结果显示，正常组与空白组比较无明显差异(P>0.05)，模型组与正常组和空白组比较显著增加(P<0.01)，低量组和西药组与模型组比较无差异(P>0.05)，中药高、中量组与模型组比较显著降低(P<0.05或0.01)，与西药组比较也有差异(P<0.01)，但两者之间无差异(P>0.05)。见表1及图1。表1补肾化痰法对大鼠海马磷酸化Tau蛋白的影响
       4讨论
       Tau蛋白是一种磷蛋白，正常的Tau蛋白每分子含有2～3个磷酸基。通过质量光谱测定法等方法发现，Tau蛋白不具备任何有规则的二级结构(如α-螺旋或β-片层结构)[3]。Tau蛋白的这种结构特征对于解释Tau蛋白病理性聚集具有重要意义。Tau蛋白是神经细胞的主要微管相关蛋白(microtubule- associatedprotein，MAP)，它的细胞功能在于与微管蛋白结合促进其聚合形成微管。正常成年个体的Tau蛋白处于低磷酸化状态，而AD患者脑中的Tau蛋白在病理条件下产生异常过度磷酸化，每分子Tau蛋白含有5～9个磷酸基团。Tau蛋白发生高度磷酸化后，其促微管组装和维持微管稳定的活性明显下降，导致神经元纤维的形态异常和轴浆转运障碍[4]。Tau蛋白的异常磷酸化可能是神经元纤维退变的早期事件。在体外研究表明，异常过度磷酸化的Tau蛋白聚集成PHF丧失了促进微管组装的生物活性，导致细胞骨架的结构异常和神经细胞凋亡[5]。PHF螺旋缠绕形成NFT。
       图1各组磷酸化Tau蛋白western blot结果本实验观察到 Aβ25-35+IBO可诱导大鼠海马组织磷酸化Tau蛋白总量增加，给予一定剂量的补肾化痰方治疗后，大鼠海马组织磷酸化Tau蛋白的水平明显下降，以补肾化痰法高、中剂量作用最明显，而低剂量则无明显作用，可能是补肾化痰方必须达到一定的浓度才会对磷酸化的Tau蛋白起抑制作用。王建枝等[6]体外研究发现当Tau蛋白去磷酸化后，可使NFT发生松解，释放出的Tau蛋白重新恢复其促微管的活力，而补肾化痰法能降低异常磷酸化的Tau蛋白水平，使其去磷酸化增多，因此有可能逆转AD的病理改变。
       AD是以本虚标实为特征的老年常见疾病，其本虚主要在于肾精不足，髓海亏虚，清阳不升，五神失用;其标实在于痰浊蒙蔽脑窍，闭阻脑络。由于其与增龄密切相关，一方面肾虚为主的五脏虚衰可导致痰浊等产生，即因虚而致实;另一方面，痰浊为患又可影响气血津液的化生和运行，致本虚更甚，此所谓因实而致虚。两者互为因果，形成恶性循环。
       脑衰老、AD皆因肾亏之年，肾气已衰，精髓乏源，脑失所养，再加其它因素诱发而成。所以早在《神农本草经》所记载的健脑益智药物中，补肾药就占第一位。其后如《千金方》的孔圣枕中丹，《太平圣惠方》的圣惠益智丸等均以补肾填精为主。大量的实验研究也表明，老年肾虚者大多脑功能下降，大脑神经细胞减少，递质含量及递质受体数量均下降，内分泌功能紊乱，免疫功能下降，自身免疫和变态反应增加，体内自由基的容量过氧化物随年龄增加而积累，而抗自由基损伤的物质如SOD活性下降。此变化与现代医学解释AD病因的胆碱能假说、免疫损伤假说、代谢紊乱假说相一致，说明肾虚是AD的重要病因。
       在肾气与五脏逐渐虚衰的基础上，还将逐渐产生痰浊等实滞，也与衰老进程密切相关。人到老年肾气亏虚，蒸腾气化作用失常，津液不能蒸化而为痰浊;或肾精亏虚，阴虚火动，灼津为痰。随增龄以肾虚为主的五脏虚衰逐渐发生，势必导致气机滞涩不利，津液运行障碍，所以痰浊的产生是衰老过程中的重要变化之一。其与脑衰老、AD的关系也十分密切。明代医家张景岳首先提出痴呆病名并强调了痰与痴呆的关系。痰浊蒙蔽清窍，则视、听、语言障碍，健忘，情志异常。痰浊流注经络，则肢体活动受限，困倦懒动。痰浊一方面因衰老而产生，反过来又进一步损害脏腑功能，加快脑衰老进程或AD的发生。
       本实验以肾虚痰阻为主要病机，也就抓住了AD的本质和发展的一般规律;以补肾化痰为治疗大法组方遣药，防治AD，可以说是抓住了治疗AD根本，做到标本兼顾。痰浊既是病理产物也是致病因素，痰浊的形成是一个病理生理过程，而补肾化痰法能有效地减少Tau蛋白的异常磷酸化，这提示：Tau蛋白的异常磷酸化可能是痰阻脑窍的物质基础，是痰浊的微观显现。临床上以补肾化痰治疗AD获效的报道[7～10]，也证实了AD的病理演化是以肾虚痰阻为主，用药物反证方法证明了肾虚痰浊与Tau蛋白异常磷酸化具有相关性。
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